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Jun 27, 2023

Nature Microbiology volumen 7, páginas 1376–1389 (2022)Cite este artículo

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La variante Omicron del SARS-CoV-2 tiene niveles muy altos de transmisión, es resistente a la neutralización mediante anticuerpos monoclonales humanos (mAb) terapéuticos autorizados y es menos sensible a la inmunidad mediada por vacunas. Para proporcionar terapias adicionales contra Omicron, aislamos un mAb llamado P2G3 de un donante vacunado previamente infectado y demostramos que tiene actividad neutralizante de rango picomolar contra Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 y todas las demás variantes probadas. Resolvimos la estructura de P2G3 Fab en complejo con la espiga de Omicron utilizando microscopía crioelectrónica con una resolución de 3,04 Å para identificar el epítopo de P2G3 como un mAb de clase 3 que es diferente de los epítopos de espiga de unión a mAb informados anteriormente. Utilizando un modelo de exposición a monos SARS-CoV-2 Omicron, mostramos que P2G3 solo, o en combinación con P5C3 (un mAb de Clase 1 ampliamente activo identificado previamente), confiere una protección profiláctica o terapéutica completa. Aunque pudimos seleccionar mutantes del SARS-CoV-2 que escaparon de la neutralización por P2G3 o P5C3 in vitro, tenían una baja infectividad y las mutaciones de "escape" son extremadamente raras en las bases de datos de secuencias públicas. Concluimos que esta combinación de mAb tiene potencial como fármaco anti-Omicron.

El SARS-CoV-2 es responsable de >340 millones de infecciones confirmadas y >5,5 millones de muertes en todo el mundo1. Su propagación ha dado lugar a la aparición de variantes preocupantes (COV) que son más transmisibles y resistentes a las respuestas inmunitarias. Predominan los COV que albergan una gran cantidad de mutaciones en comparación con la cepa original de SARS-CoV-2, y Delta (B.1.617.2) y sus mutaciones de 11 a 15 picos ahora son reemplazadas en gran medida por la variante Omicron altamente infecciosa (B.1.1.529.1). ), que contiene hasta 37 mutaciones de aminoácidos en la proteína de pico2,3. Quince de las sustituciones de picos en Omicron se encuentran en el dominio de unión al receptor (RBD), la región a la que se dirigen los anticuerpos neutralizantes (ya sea inducidos por una infección o por las vacunas actuales) que se generaron contra la cepa original de Wuhan 2019-nCoV4,5,6,7 ,8. Omicron también resiste la neutralización de la mayoría de los mAb anti-SARS-CoV-2 informados hasta ahora9,10,11,12,13,14,15 y ahora circula como varias subvariantes, incluidas BA.1.1, BA.2 (B.1.1 .529.2) y BA.3 (B.1.1.529.3)2, creando una necesidad médica urgente no cubierta tanto de profilaxis como de terapéutica.

Examinamos la presencia de anticuerpos anti-pico en muestras de suero de una cohorte de >100 donantes y nos centramos en un donante posinfectado que recibió dos dosis de la vacuna mRNA-1273 y tenía uno de los niveles de anticuerpos séricos más altos, con una amplitud excelente. contra un panel de variantes del SARS-CoV-2 en un ensayo de neutralización sustituta de pico trimérico-ACE216. La detección de sobrenadantes de clones de células B para detectar la unión de picos de alta afinidad nos llevó a priorizar seis clones para la producción de mAb mediante la expresión de cadenas pesadas y ligeras emparejadas en células ExpiCHO. Durante el perfil inicial de estos mAb purificados, P2G3 exhibió la afinidad de unión más fuerte por el trímero de pico 2019-nCoV original y un panel de proteínas de pico que codifican mutaciones encontradas en COV Alfa, Beta, Gamma y Delta (IC50 de 0,006–0,010 µg ml-1). ) (Datos ampliados Fig. 1a). Estudios de unión de RBD de picos competitivos cruzados realizados con un panel de mAb anti-SARS-CoV-2 autorizados o clínicamente avanzados (REGN10933 y REGN10987 de Regeneron17, AZD8895 y AZD1061 de AstraZeneca18, ADG-2 de Adagio19, S309/Sotrovimab de Vir/GSK20 ) y los mAb descritos previamente por nuestro grupo21 demuestran que P2G3 se une a un epítopo único, aunque superpuesto, con los reconocidos tanto por AZD1061 como por S309/Sotrovimab, este último actúa mediante un mecanismo distinto del bloqueo de la interacción RBD/ACE220 (Datos ampliados, figura 1b). Es importante destacar que nuestro potente y ampliamente activo mAb de Clase 1, P5C3, se unió a RBD de forma no competitiva con P2G3, lo que nos llevó a perfilar estos mAb solos y en combinación para estudios posteriores.

Utilizando un ensayo bioquímico de neutralización sustituta de pico trimérico-ACE216, determinamos además que P2G3 y P5C3 tenían la actividad más potente y amplia para bloquear la unión de ACE2 a trímeros de pico de grado estructural de alta calidad de todos los VOC anteriores en comparación con nuestro panel de mAb de referencia (Datos extendidos). Figuras 1c,d). P2G3 y P5C3 también mostraron la actividad más potente en ensayos realizados con la proteína de pico de Omicron BA.1, BA.1.1 que incluye la mutación R346K y BA.2. (Figuras 1a,b). P2G3 solo proporcionó actividades comparables con la combinación P2G3/P5C3, con el cóctel mostrando valores de IC80 mejorados 6,1, 47,2 y 3,4 veces frente a la mezcla AZD1061/AZD8895, valores de IC80 mejorados 9,9, 12,4 y 340 veces frente a ADG- 2, y valores de CI80 mejorados 375, 337 y 32 veces en comparación con la mezcla REGN10933/REGN10987 en ensayos realizados con Omicron BA.1, BA.1.1 y BA.2, respectivamente. Curiosamente, mientras que la combinación P2G3/P5C3 alcanzó ~100% de inhibición en el bloqueo de la unión de ACE2 a las proteínas de pico Omicron con 1 µg ml-1 de mAb totales, P2G3 solo bloqueó solo entre el 50 y el 72 % de la unión de ACE2 con 20 µg ml-1 y P5C3 solo. alcanzó una inhibición de ~100% a 20 µg ml-1.

a, Actividad de bloqueo de mAb individuales y combinaciones de mAb anti-picos en un ensayo bioquímico de neutralización sustituta de pico-ACE2 utilizando Omicron BA.1, BA.1.1 que codifica la mutación R346K y las proteínas trímeras de pico variante BA.2. Se muestran la media ± sem. b, Actividad de bloqueo comparativa de pico-ACE2 de P2G3, P5C3 y la mezcla P2G3/P5C3 en comparación con un panel de mAb anti-SARS-CoV-2 de referencia. P2G3 y P5C3 utilizados en estos estudios y en todo el manuscrito contienen la mutación LS en el dominio Fc (M428L/N434S), que previamente se demostró que confiere una vida media prolongada in vivo. Los datos presentados son réplicas biológicas con n = 8, 7, 8, 8, 7, 5, 6, 7 y 4 para mAb en orden de aparición en la leyenda.

Datos fuente

Comparamos P2G3 solo, o en combinación con P5C3, con nuestro panel de mAb actuales clínicamente autorizados y/o clínicamente avanzados en ensayos de neutralización de pseudovirus. P2G3 tuvo una potente actividad neutralizante contra lentivirus pseudotipados con picos de los COV iniciales 2019-nCoV (D614G), Alfa, Beta y Delta (valor de IC80 de 0,022, 0,051, 0,038 y 0,035 µg ml-1, respectivamente). Es importante destacar que P2G3 neutralizó fuertemente el pseudovirus de pico Omicron BA.1 con un valor de IC80 de 0,038 µg ml-1 (Fig. 2a) y, por lo tanto, no mostró pérdida de actividad en comparación con los otros COV. En comparaciones lado a lado, P2G3 fue >42 veces más potente que los mAb ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 y REGN10987 y 19 veces más potente que Sotrovimab para neutralizar las partículas lentivirales pseudotipadas con picos de Omicron BA.1 (Fig. .2b). El segundo más potente fue P5C3, con un valor de CI80 de 0,223 µg ml-1, y la combinación P2G3/P5C3 reveló una actividad ligeramente mejorada sobre P2G3 solo en este ensayo, con un valor de CI80 de 0,024 µg ml-1 para la concentración total. de los dos mAb. Además, P2G3 y P5C3 mantuvieron una actividad neutralizante completa contra el ancestral D614G y Omicron BA.1.1 que codifica el pseudovirus de pico R346K (Datos ampliados, Fig. 2a, b), una mutación presente en ~ 10% de las secuencias variantes de Omicron en GISAID11.

a, Neutralización de partículas lentivirales pseudotipadas con COV que expresan picos de SARS-CoV-2 en un ensayo de infección 293T-ACE2. Todas las proteínas de pico contenían la sustitución D614G que se volvió dominante al principio de la pandemia. Las réplicas en las curvas de concentración-respuesta fueron n = 5, 5, 6, 8 y 6 para las variantes 2019-nCoV, Alpha, Beta, Delta y Omicron, respectivamente. b, Neutralización de partículas lentivirales pseudotipadas con la variante Spike de Omicron. Los cócteles de anticuerpos representan una mezcla 1:1 de cada mAb para dar la concentración total de mAb indicada. Las réplicas de mAb en orden de aparición en la leyenda son n = 9, 9, 9, 7, 7, 7, 7, 7 y 6. c – e, Actividad de neutralización de P2G3 realizada en un virus infeccioso vivo SARS-CoV-2 ensayo de efecto citopático (CPE). Las variantes indicadas del SARS-CoV-2 se utilizaron para infectar células Vero E6 in vitro en ausencia y presencia de respuesta de concentración del mAb indicado. Se muestran las curvas de inhibición viral para Delta (c, n = 4 réplicas), Omicron BA.1 (d, n = 4 réplicas) y Omicron BA.2 (e, n = 6 réplicas para P2G3 y P5C3, n = 4 para P2G3+P5C3 y n = 2 para los mAb restantes) variantes para combinaciones individuales y de mAb. f, Mapa de calor que muestra las potencias de neutralización de IC50 y IC80 para los mAb indicados en los ensayos de CPE de virus vivos calculados a partir de c-e. Para a–e, se muestran la media ± sem.

Datos fuente

A continuación, perfilamos P2G3 utilizando la cepa D614G inicial y todos los VOC actuales en un ensayo de efecto citopático de virus vivo. P2G3 demostró una actividad neutralizante amplia y potente con valores de IC80 de 0,028, 0,010, 0,017, 0,021, 0,024 y 0,035 µg ml-1 contra la cepa 2019-nCoV (D614G), variantes Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, respectivamente (IC80 que van desde 67 a 233 pM) (Datos ampliados, figura 2c). Continuamos comparando P2G3 con otros mAb solos o en combinaciones por su capacidad para bloquear las variantes Delta y Omicron BA.1 y BA.2 del SARS-CoV-2 actualmente prevalentes (Fig. 2c-f). Todos los mAb probados mostraron una buena actividad contra la variante Delta, aunque Sotrovimab fue ~6 veces menos potente que ADG-2 y >10 veces menos potente que P2G3, P5C3 y los cócteles AZD y REGN contra este virus.

Es de destacar que P2G3 fue, con diferencia, el mAb más activo contra Omicron BA.1 con un valor de CI80 de 0,035 µg ml-1, que es aproximadamente 23, 60 y 88 veces más potente que los de AZD1061/AZD8895. Sotrovimab y ADG-2, respectivamente, siendo la combinación REGN completamente ineficaz contra esta variante (Fig. 2d, f). Aunque P5C3 tenía una IC80 contra Omicron en el rango del cóctel AZD, la combinación P2G3/P5C3 mostró una alta actividad de neutralización comparable a la de P2G3 solo, con una IC80 de 0,039 µg ml-1 de mAb total. P2G3 volvió a ser el mAb más potente para neutralizar la variante Omicron BA.2 con un valor de CI80 de 0,014 µg ml-1, que es 4,9, 14, 907 y 607 veces más potente que AZD1061/AZD8895. REGN10933 / REGN10987, ADG-2 y Sotrovimab, respectivamente (Fig. 2e-f). Es importante destacar que, aunque el ensayo de neutralización sustituta de pico-ACE2 se correlaciona bien con los ensayos de neutralización basados ​​en células16, P2G3 solo bloqueó ~50-72% de la unión de ACE2 a las proteínas de pico Omicron (Fig. 1a) a pesar de que P2G3 alcanzó el 100% de la señal máxima en un ensayo de unión directa (Datos ampliados, figura 1e). Esto sugiere que, al menos con la variante Omicron, la inhibición del virus por P2G3 puede no estar mediada únicamente a través de la interacción pico-ACE2, sino más bien a través de un mecanismo análogo al de S309/Sotrovimab, que se informa se produce mediante la inducción del entrecruzamiento del trímero de pico. , impedimento estérico, agregación de viriones20 y/o inhibición de la unión a la membrana viral a través de receptores de lectina tipo C22.

Dada la importancia potencial de la actividad funcional de los anticuerpos que está mediada a través de la región Fc de inmunoglobulina constante y puede conducir a un control y eliminación del virus más eficiente23,24,25, investigamos las actividades de P2G3 en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Ensayos de fagocitosis (ADCP). ADCC permite la destrucción dirigida de células que muestran la proteína de pico de SARS-CoV-2 en la superficie de la membrana y nuestro ensayo in vitro utiliza células CEM-NKR que expresan de manera estable el pico de 2019-nCoV cultivadas con células efectoras primarias de donantes sanos en presencia y ausencia de mAb anti-picos. El mAb P2G3 exhibió una sólida actividad ADCC que fue superior en la destrucción de células positivas para picos en comparación con todos los demás mAb anti-picos probados (Datos ampliados, figura 3a). Aunque estos estudios no se realizaron con una línea celular estable de picos de Omicron, generalmente se acepta que la actividad funcional de ADCC se mantiene contra los diferentes COV del SARS-CoV-2 para los mAb que conservan la unión de la variante de picos26. A continuación, evaluamos la actividad de ADCP utilizando perlas fluorescentes recubiertas de trímero de pico 2019-nCoV u Omicron BA.1 mezcladas con diferentes concentraciones de P2G3 y/o P5C3 y luego incubadas con células efectoras U937. Esta línea celular de monocitos expresa altos niveles de receptores Fc-gamma capaces de inducir la fagocitosis de virus opsonizados o perlas recubiertas con el antígeno de pico como en nuestro ensayo (Datos ampliados, figura 3b). Usados ​​solos, los mAb P2G3 y P5C3 mostraron actividades ADCP IC80 de 0,074 y 0,010 µg ml-1, respectivamente, y P5C3 mostró una potencia ~7 veces mayor. Por el contrario, al utilizar perlas recubiertas con púas de Omicron, P2G3 exhibió una potente actividad ADCP que mejoró 3 veces en relación con la de P5C3. En estudios realizados con picos ancestrales y Omicron, la mezcla P2G3/P5C3 muestra actividades ADCP mejoradas en comparación con los mAb utilizados individualmente (Datos ampliados, Fig. 3c, d). Es de destacar que P2G3 y P5C3 utilizados en estos ensayos de actividad funcional mediada por Fc y en todo el artículo contienen la mutación LS en el dominio Fc (M428L/N434S), que previamente se demostró que confiere una vida media prolongada in vivo27, una característica muy deseable para uso profiláctico.

Habiendo demostrado la actividad neutralizante superior in vitro de P2G3, a continuación evaluamos la potencia neutralizante de P2G3 in vivo en un modelo de desafío profiláctico en hámster de la infección por SARS-CoV-2. Los animales a los que se les administró anticuerpos fueron expuestos 2 días después con una inoculación intranasal del virus 2019-nCoV SARS-CoV-2 original (Datos ampliados, figura 4a) y luego, 4 días después, se monitoreó el tejido pulmonar del hámster para detectar virus infecciosos y ARN viral. El virus infeccioso fue indetectable en los pulmones de casi todos los hámsteres tratados con P2G3, y solo 1 de 6 hámsteres en el grupo con la dosis más baja de 0,5 mg kg-1 mostró niveles reducidos, aunque detectables, de virus infeccioso en comparación con los animales de control tratados con isotipo mAb (Datos ampliados). Figura 4b). Se observó una protección profiláctica completa con niveles plasmáticos de mAb P2G3 >6,2 µg ml-1 en el momento de la inoculación viral y los grupos de tratamiento con P2G3 mostraron una reducción significativa de ~4 log de los niveles de ARN viral genómico (Datos ampliados, figura 4c).

A continuación, evaluamos la protección mediada por P2G3 contra la infección por SARS-CoV-2 Omicron BA.1 en un estudio de exposición previa al macaco cynomolgus. A los monos (n = 2) se les administraron 10 mg kg-1 de P2G3 LS por vía intravenosa y 72 h después se les expuso mediante vías intranasal e intratraqueal combinadas con 1 × 105 dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50 % (TCID50) de SARS-CoV-2 B.1.1. .519 Virus Omicron BA.1 (Fig. 3a). Después de la exposición viral, los animales de control (n = 4) mostraron niveles y cinética de ARN genómico (g) similares, con cargas virales máximas (VL) medianas de 6,9 ​​y 6,6 log10 copias por ml de ARNg entre 2 y 3 días después de la exposición en traqueal. hisopos y muestras de lavado broncoalveolar (BAL), respectivamente (Fig. 3b). Los hisopos nasofaríngeos mostraron una variabilidad de mayor nivel en la VL entre los animales de control, pero aún mostraron picos medios de 6,9 ​​log10 copias por ml para gRNA. En comparación, los dos monos tratados con P2G3 LS tuvieron una fuerte reducción máxima de ΔVL de 3,8, 2,5 y 3,9 log10 copias por ml de ARNg para muestras traqueales, nasofaríngeas y BAL, respectivamente.

a, Descripción general del diseño del estudio para el modelo de desafío NHP SARS-CoV-2. A los animales MF1 y MF2 se les administraron por vía intravenosa 10 mg kg-1 de P2G3 y se les expuso 3 días después (día 0) junto con los animales de control MF3 y MF4 mediante inoculación intranasal e intratraqueal del virus Omicron BA.1 SARS-CoV-2 (1 × 105 TCID50). b,c, Se evaluaron hisopos traqueales (izquierda), hisopos nasofaríngeos (centro) y lavados broncoalveolares (BAL, derecha) realizados durante el curso del estudio para determinar las copias virales por ml de ARNg (b) y ARNsg (c), con datos. trazado para incluir dos animales de control históricos (MF5* y MF6*) infectados con el mismo inóculo del virus Omicron. d, El análisis de citometría de flujo de muestras de sangre de NHP recolectadas a lo largo del estudio muestra una fuerte linfopenia en animales de control luego de la exposición a Omicron SARS-CoV-2, mientras que los monos tratados con P2G3 LS muestran niveles estables de linfocitos. La línea de puntos indica el límite inferior de detección de 2,68 y 2,87 log copias por ml para gRNA y sgRNA virales, respectivamente.

Datos fuente

La replicación viral activa, evaluada por los niveles de ARN subgenómico (sg), alcanzó su punto máximo entre 2 y 3 días después de la exposición, con hisopos traqueales y BAL que mostraron valores medios de 4,8 y 4,5 log10 copias por ml, respectivamente, y muestras nasofaríngeas que mostraron respuestas variables. que van desde indetectables (<2,9-log10) hasta 5,4-log10 copias por ml (Fig. 3c). Los monos tratados con P2G3 LS tenían niveles de sgRNA que estaban en el límite de detección o por debajo de él, exhibiendo niveles reducidos de 1,9, 2,2 y 1,6 log10 en muestras traqueales, nasofaríngeas y BAL, respectivamente. De acuerdo con la protección viral que resultó en una detección reducida de ARNg y ARNsg, los monos tratados con P2G3 exhibieron niveles de linfocitos estables durante todo el estudio, mientras que se observó una fuerte linfopenia, determinada por niveles de linfocitos por debajo de 2,1 × 103 células por µl, en todos los animales de control expuestos al Variante Omicron del SARS-CoV-2 (Fig. 3d).

En un segundo estudio para evaluar la eficacia terapéutica de los mAb, los monos fueron expuestos al virus SARS-CoV-2 B.1.1.519 Omicron BA.1 como se indicó anteriormente y luego, 24 h después de la exposición, los animales de tres grupos no fueron tratados (n = 4 ) o se administró una combinación de P2G3 LS + P5C3 LS a 5 + 5 mg kg-1 (n = 6) o 2,5 + 2,5 mg kg-1 (n = 6) mediante una única inyección intravenosa (Fig. 4a). Las muestras traqueales, nasofaríngeas y de BAL recolectadas longitudinalmente para cada mono se evaluaron para determinar las copias virales por ml de ARNg (Fig. 4b) y ARNsg (Fig. 1 complementaria). De acuerdo con el estudio de exposición profiláctica, los animales de control mostraron niveles de gRNA y perfiles cinéticos comparables, con una mediana de VL máxima de 6,7 y 6,1 log10 copias por ml 2 a 3 días después de la exposición en hisopos traqueales y muestras de BAL, y valores elevados pero más variables. niveles de VL nasofaríngeo de 6,5 log10 copias por ml de ARNg (Fig. 4c). Es importante destacar que los monos en el brazo de tratamiento combinado de 5 + 5 mg kg-1 P2G3 LS + P5C3 LS mostraron una mediana de ΔVL pico fuerte y significativamente reducida de 2,1 y 1,5 log10 para muestras traqueales y BAL (P = 0,0095 para cada una), respectivamente. y 1,2 log10 copias por ml de ARNg para muestras nasofaríngeas (Fig. 4c). De manera similar, los monos tratados con la combinación de mAb de dosis más baja de 2,5 + 2,5 mg kg-1 mostraron una reducción máxima media de ΔVL de 0,85-1,1- y 1,2-log10 copias por ml de ARNg para muestras traqueales, BAL y nasofaríngeas, respectivamente, y las muestras BAL mostraron significativamente niveles reducidos (P = 0,0095) (Fig. 4c). La eficacia terapéutica se demostró además mediante el seguimiento de los niveles del área bajo la curva (AUC) de ARNg, donde la combinación de dosis altas y bajas de P2G3 LS + P5C3 LS ejerció una reducción significativa de 4 y 2,5 veces en el virus detectado en la tráquea (P = 0,0095 y 0,0190, respectivamente) y niveles de AUC de ARNg reducidos 2,5 y 2,2 veces, respectivamente, en fluidos nasofaríngeos en relación con los monos de control no tratados (Fig. 4d).

a, Descripción general del diseño del estudio para el modelo terapéutico de desafío NHP del SARS-CoV-2. Los animales fueron desafiados mediante inoculación intranasal e intratraqueal del virus Omicron BA.1 SARS-CoV-2 (1 × 105 TCID50) el día 0 y 24 h después, al grupo 2 (G2, círculos rojos, n = 6) se les administró NHP por vía intravenosa. 5 mg kg-1 de P2G3 LS y 5 mg kg-1 de P2G3 LS, al grupo 3 (G3, círculos rosados, n = 6) se le administraron 2,5 mg kg-1 de P2G3 LS y 2,5 mg kg-1 de P2G3 LS, y el grupo 1 (G1, círculos grises, n = 4) se utilizaron como controles de referencia no tratados. b – e, se evaluaron hisopos traqueales, hisopos nasofaríngeos y lavados broncoalveolares (BAL) realizados durante el transcurso del estudio para determinar las copias virales por ml de ARNg (b – d) y ARNsg (e). Los grupos de estudio se evaluaron para determinar el pico de ARNg (c), el área bajo la curva de ARNg (d) y las copias virales máximas de ARNg por ml (e) en las diferentes muestras recolectadas y en diferentes momentos. La línea de puntos indica el límite inferior de detección de 2,68 y 2,87 log copias por ml para gRNA y sgRNA virales, respectivamente. Se muestran la media ± sem. Se realizaron pruebas bilaterales de Mann-Whitney para comparar los grupos de estudio en c, d y e; **P = 0,0095 para todos en c; **P = 0,0095 y *P = 0,019 para d; ***P = 0,0005, **P = 0,0062, 0,0095, 0,0095 (de izquierda a derecha) para e.

Datos fuente

La replicación viral activa también se inhibió significativamente en los brazos de tratamiento de dosis alta y baja, y los hisopos traqueales mostraron una reducción de 41 y 8,8 veces en el sgRNA en los días 2/3 posteriores a la exposición (P = 0,0005 y 0,0062), respectivamente (Fig. 4e). . Las combinaciones de tratamiento P2G3 LS + P5C3 LS redujeron además el sgRNA en muestras de BAL en 6,2 y 8,8 veces en comparación con los monos de control no tratados (P = 0,0095 para ambos) (Fig. 4e). En general, estos estudios respaldan firmemente la eficacia terapéutica de la combinación P2G3 LS + P5C3 LS para eliminar el virus e inhibir la replicación viral activa de la variante Omicron BA.1 de gran relevancia.

Para descifrar las características moleculares que subyacen a la potente neutralización de P2G3 y P5C3 del pico de Omicron, realizamos una reconstrucción con microscopía crioelectrónica (crio-EM) de una sola partícula del ectodominio trimérico del pico de Omicron12,28,29 unido a ambos Fabs, con una resolución de 3,04 Å. (Fig. 5a, Datos ampliados, Figs. 5 y 6, y Tabla de datos complementarios 1). Descubrimos que los Fab se unen simultáneamente en distintos sitios del trímero, y la mayoría de las imágenes revelan tres Fab P2G3 unidos a conformaciones de RBD hacia arriba o hacia abajo y un Fab P5C3 unido a un RBD hacia arriba. La región del Omicron RBD que interactúa con el mAb P5C3 de clase 1 es idéntica a la descrita anteriormente para el pico D614G (datos ampliados, figuras 5 a 7)21. P2G3 se une a un área de superficie de alrededor de 700 Å2 como un mAb4 neutralizante de Clase 3, reconociendo un epítopo en el RBD del SARS-CoV-2 distinto del motivo de unión al receptor, con los dos mAb juntos cubriendo una superficie> 1200 Å2 (Fig. 5b y datos ampliados, figuras 7a y 8a). Para caracterizar en detalle la interfaz del paratopo y el epítopo de P2G3, realizamos un refinamiento local de la región de interacción Fab-RBD de P2G3 y alcanzamos una resolución de 3,84 Å con una densidad bien definida, lo que permite una interpretación clara de las posiciones de las cadenas laterales (Datos ampliados, figuras 6 y 8). , y figura complementaria 2 y tabla de datos 1). El paratopo P2G3 está compuesto por cuatro bucles de la región determinante de la complementariedad (CDR) que se unen a la parte posterior del RBD. Las interacciones están mediadas a través de contactos electrostáticos e hidrofóbicos (Fig. 5c, d y Datos ampliados Fig. 8b, c) e involucran 16 residuos del RBD, principalmente unidos por la cadena pesada del mAb P2G3. El CDRH3 de 18 residuos de largo se encuentra en la parte superior de un bucle que comprende los residuos 344–347, y también contacta con los aminoácidos en los límites de la hoja β de 5 cadenas (residuos 440–451), lo que en general representa >60 % de la superficie enterrada (431 Å2) (Datos ampliados Fig. 8a-c). Las interacciones entre P2G3 y Omicron RBD se conservan tanto en los estados RBD arriba como RBD abajo (Datos extendidos Fig. 8c, d). CDRH2 extiende el epítopo al interactuar con R346 que está comprometido con el residuo W53 a través de una posible interacción catión-pi (Fig. 5d y Datos extendidos Fig. 8e), una interacción que probablemente se conserva con la sustitución de pico R346K (Datos extendidos Fig. 2a ,b). El único contacto potencial de la cadena ligera se deriva de que CDRL1 Y32 forma una interacción hidrofóbica con V445 del RBD (Datos ampliados, figura 8c). Además, solo se observa que P2G3 entra en contacto con residuos de aminoácidos de RBD y la distancia al átomo más cercano de la rama de glicano es ~10 Å de P2G3. Es importante destacar que el epítopo definido por nuestros estudios estructurales racionaliza la potente actividad neutralizante de P2G3 contra la variante Omicron en relación con otros mAb de clase 3. Las mutaciones de Omicron S371L, N440K, G446S y la subvariante menor R346K están situadas fuera, adyacentes o tienen poco efecto sobre el reconocimiento del epítopo de unión a P2G3, mientras que dos o más de estas mutaciones inciden directamente en los epítopos reconocidos por REGN10987. AZD1061 y S309/Sotrovimab (Fig. 5e). Además, P2G3 muestra una orientación de unión única en el RBD, con su Fab alejándose de la mayoría de estas mutaciones de Omicron (Fig. 5f). Al modelar los ángulos de ataque observados de varios mAb de Clase 3, es posible que REGN10987 solo se una a la forma RBD superior, mientras que AZD1061 se una a una forma RBD superior y otra inferior, con impedimento estérico bloqueando el tercer sitio RBD en Omicron. trímero de espiga (Datos ampliados, Fig. 9). Por el contrario, P2G3 y S309/Sotrovimab probablemente se unen a las formas arriba y abajo de Omicron RBD sin conflictos (Fig. 5g y Datos ampliados Fig. 9c), una característica que puede contribuir a la potencia alta y en gran medida conservada de P2G3 en todos los COV.

a, mapa de densidad compuesto Cryo-EM de la punta Omicron de longitud completa unida a un fragmento Fab P5C3 y tres fragmentos P2G3. Los protómeros de pico están coloreados en verde, naranja y azul, P5C3 Fabs en naranja oscuro y claro, P2G3 en negro y gris. b, Representación superficial del RBD en la configuración superior (verde) unido a P5C3 y P2G3, con las cadenas pesadas y ligeras representadas como cintas de regaliz. La superficie enterrada formada por los Fabs se representa en la superficie RBD y está coloreada en gris para P2G3 y naranja para P5C3. Las mutaciones de Omicron se muestran en amarillo como bolas y palos y superficies transparentes. Los glicanos unidos a N en la asparagina 331 y 343 se muestran como barras. El panel derecho muestra una rotación de 180° del complejo RBD/P2G3/P5C3 en relación con el panel izquierdo. c, Vista ampliada de la región que interactúa de P2G3 con los bucles CDR de las cadenas pesada y ligera especificadas. Las mutaciones de Omicrón están resaltadas en amarillo. d, Análisis detallado de las interacciones entre Omicron RBD que se muestra como cintas (verde) y las cadenas pesadas y ligeras de P2G3 Fab que se muestran como regaliz (negro y gris). Los residuos en la interfaz se muestran como palos, y las posibles interacciones de interés se muestran como líneas discontinuas. Las mutaciones en ómicrones se muestran como bolas y palos en amarillo. e, Se superpusieron estructuras de varios anticuerpos de clase 3 (Fab) unidos a RBD en el RBD de Omicron. La superficie enterrada formada por los Fabs indicados está delineada en la superficie RBD y coloreada correspondientemente (estructuras Fab-RBD AZD1061, PDB-7L7E; REGN10987, PDB-6XDG; S309, PDB-7BEP). Las mutaciones de Omicron se muestran en amarillo como bolas y palos y superficies transparentes. f, el ángulo de ataque de unión de Fab al RBD se define como la línea que conecta el centroide del Fab con el centroide del área de superficie del RBD que entierran los Fab. El ángulo de ataque de P2G3 se compara con el de otros anticuerpos de clase 3, visto desde múltiples ángulos. RBD está en verde, las mutaciones Omicron en amarillo. g, la unión de P2G3 al trímero Omicron completo se modeló superponiendo los Fabs al RBD de cada protómero. El complejo se muestra desde diferentes lados y desde arriba. Los P2G3 Fabs pueden unir todas las conformaciones RBD arriba y RBD abajo simultáneamente.

Los anticuerpos monoclonales, al igual que otras clases de antivirales, suelen usarse en combinación para prevenir la aparición de virus resistentes. Para comprender mejor el valor clínico previsto de nuestros mAb, caracterizamos la aparición de mutantes que escapan de su bloqueo en cultivos de tejidos. Para ello, cultivamos variantes Delta del SARS-CoV-2 y Omicron BA.1 en presencia de dosis neutralizantes subóptimas de P2G3 o P5C3 durante tres pases para generar una población viral heterogénea, antes de cambiar a concentraciones estrictas de mAb para seleccionar fugitivos genuinos. (Figura 6a). La secuenciación del genoma viral de estos mutantes resistentes a mAb señaló la importancia de las sustituciones de picos G476D, F486S y N487K/D/S para escapar de P5C3, y K444T para evitar la neutralización de P2G3. Por lo tanto, probamos el impacto de estas mutaciones en la infectividad viral utilizando pseudotipos de lentivectores. Las proteínas de pico que escapan de P5C3 fueron significativamente menos infecciosas que el control de tipo salvaje tanto en el entorno ancestral D614G como en Delta, lo que se correlaciona con una caída en la afinidad por el receptor viral ACE2 en un ensayo de unión in vitro, mientras que la sustitución de K444T que escapa de P2G3 tuvo un efecto más leve en ambos ensayos (Fig. 6b, c). Sin embargo, un examen de la base de datos GISAID EpiCoV reveló que las mutaciones G476D, F486S o N487K/D/S encontradas en los fugitivos de P5C3 solo se encuentran excepcionalmente en los aislados de SARS-Cov-2, y en conjunto representan solo el 0,0087% de las 8.568.006 secuencias disponibles en marzo. 2022, y que la mutación K444T es igualmente rara (0,0024 % de las secuencias compiladas), lo que sugiere fuertemente que los virus correspondientes tienen una aptitud notablemente reducida en la naturaleza. Además, los estudios de neutralización cruzada demostraron que P2G3 bloqueó completamente la infectividad de los derivados Delta que escapaban de P5C3 (Fig. 6d), y P5C3 y P2G3 neutralizaron eficientemente los mutantes de escape entre sí en los fondos Delta (Datos ampliados, Fig. 10).

a, Representación esquemática de la selección de fugitivos. Se utilizaron aislados replicativos de Delta y Omicron para infectar células Vero E6 (MOI de 0,2), cada uno por duplicado, en presencia de concentraciones subóptimas de anticuerpos. Los sobrenadantes se recogieron, se diluyeron 40 veces y se usaron para infectar células durante dos pases más en las mismas condiciones (P1 a P3). Los supuestos virus escapados se seleccionaron además mediante pases en serie de sobrenadantes diluidos al doble y preincubados con altas concentraciones de anticuerpos (tres concentraciones, cada una analizada por duplicado). El ARN viral extraído de los sobrenadantes recolectados en cada pase se secuenció en profundidad y el sobrenadante viral P5 se usó para ensayos de neutralización basados ​​en CPE. b, Las mutaciones identificadas en los experimentos de selección de escape se indican en la tabla. Se produjeron lentivectores pseudotipados con picos mutados en los residuos identificados en paralelo con reservas ajustadas para el contenido de p24 y la misma cantidad de cada lentivector utilizada para transducir células 293T ACE2. En el panel D614G, las réplicas de izquierda a derecha fueron n = 36, 36, 8, 8, 28 y 28. El panel de la variante Delta tiene n = 39, 36, 8, 8, 34 y 34 réplicas, respectivamente. La eficacia de la transducción se controló mediante la actividad luciferasa (RLU) en las células transducidas. c, La unión directa de ACE2 a picos triméricos mutados se monitoreó mediante ensayos de unión basados ​​en Luminex (n = 2–3 réplicas biológicas). d, las células Vero E6 se infectaron por duplicado con cantidades normalizadas de escapes Delta o Delta P5C3 recolectados de los experimentos de selección de escapes y se preincubaron o no con diluciones en serie triples de mAb como se indica. El efecto citopático se controló 2 días después con tinción con violeta cristal de las células vivas. Cuadrados grises y naranjas: células infectadas con virus en ausencia de mAb y células no infectadas, respectivamente. Se realizaron pruebas de Kruskal-Wallis con corrección de comparación múltiple de Dunn para comparar el tipo salvaje y los mutantes: para b, *P = 0,028 y 0,045 (de izquierda a derecha), **P = 0,0026 y 0,0086 (de izquierda a derecha) y * ***P < 0,0001; NS, no significativo; para c, *P = 0,046 y **P = 0,0088. Las barras de error representan la media ± sd

Datos fuente

Informamos la identificación y caracterización de P2G3, un mAb anti-SARS-CoV-2 con amplitud y potencia superiores que puede neutralizar todos los COV hasta el momento, incluidas las variantes Omicron BA.1 y BA.2 recientemente identificadas. Los estudios de unión estructural y competitiva demuestran que P2G3 es un mAb de clase 3 que reconoce un epítopo en el RBD diferente de los unidos por todos los demás mAb terapéuticos autorizados o en una etapa avanzada de desarrollo8,10,11. Los análisis de secuencia también revelaron que P2G3 HCDR3 presenta solo un 55 % de identidad con cualquiera de los 4.897 HCDR3 anti-picos descritos hasta ahora.

Cryo-EM reveló que P2G3 puede unirse a las conformaciones RBD arriba y abajo del trímero de púas, enterrando una gran superficie de alrededor de 700 Å2 en una región altamente conservada de RBD. Es importante destacar que el epítopo de unión no se superpone en gran medida con los residuos mutados en Omicron, una característica única entre casi todos los mAb anti-SARS-CoV-2 potentes informados hasta ahora11. La mutación S371L Omicron por sí sola reduce notablemente la actividad de neutralización de múltiples mAb potentes de diferentes clases de unión a pesar de no estar incluidos en su huella11, tal vez porque los cambios conformacionales locales en el bucle 370-375 impactan los estados arriba y abajo de RBD y/o interfieren con el abridor de puerta crítico N343 posicionamiento de glicano30; sin embargo, esta mutación no tiene efecto sobre la neutralización de P2G3. El ángulo de ataque único de P2G3 en el dominio RBD, que se prevé que permitirá la unión en las posiciones RBD superior e inferior del trímero de pico, puede explicar por qué este anticuerpo sigue siendo potentemente activo contra la variante Omicron.

Predijimos que S309/Sotrovimab también está estéricamente libre para unirse a todos los RBD dentro del trímero Omicron, pero descubrimos que este anticuerpo tenía una marcada pérdida de actividad contra esta variante. Aunque el epítopo unido por P2G3 se superpone parcialmente con la región reconocida por S309/Sotrovimab, este último mAb no bloquea la interacción RBD/ACE2 y se ha propuesto que actúa mediante mecanismos alternativos que incluyen la inhibición de la adhesión celular a través de lectinas de tipo C22. Por lo tanto, la afinidad de unión mejorada de P2G3 combinada con el efecto inhibidor adicional sobre la interacción RBD/ACE2 ayuda a explicar su actividad mejorada de 10 a 60 veces en todos los COV en comparación con S309-Sotrovimab. Además de la actividad de neutralización in vitro, P2G3 solo y/o en combinación con P5C3 confiere una excelente protección in vivo en el modelo de desafío de primates no humanos (NHP) Omicron SARS-CoV-2 tanto en entornos profilácticos como terapéuticos. Nuestros datos de NHP también confirman estudios en ratones y hámsteres que indican que la variante Omicron tiene una capacidad de proliferación reducida en varios modelos animales en comparación con otros COV31,32.

A pesar del perfil de neutralización excepcional de P2G3 contra las variantes que circulan actualmente, el desarrollo de resistencia es inevitable cuando un virus está bajo presión selectiva. Aquí informamos que P5C3, un mAb neutralizante potente y ampliamente activo descrito previamente que actúa bloqueando la interacción pico-ACE2, no solo se dirige a una región altamente conservada del RBD, sino que también puede unirse al pico Omicron concomitantemente con P2G3. Además, identificamos mutantes capaces de escapar de la neutralización por cualquiera de estos mAb, pero demostramos que tienen una infectividad reducida, son extremadamente raros en la naturaleza (lo que sugiere una aptitud reducida) y pueden neutralizar eficientemente a los fugitivos de cada uno, validando así su uso en combinación. Es de destacar que tanto P5C3 como P2G3 neutralizan las subvariantes Omicron BA.1.1 y BA.2 que ahora prevalecen con R346K, que escapan parcial o completamente al bloqueo de otros mAb actualmente disponibles. Además, las variantes emergentes de Omicron BA.4 y BA.5 con mutaciones RBD L452R y F486V están distantes del epítopo de unión P2G3 y es poco probable que afecten la actividad neutralizante2.

Muchos de los avances logrados hasta ahora en la pandemia de COVID-19, incluidas las vacunas contra la COVID-19 y los potentes mAb neutralizantes, se vieron erosionados en gran medida en unos meses por la aparición de las variantes Delta y Omicron. La variante Omicron muestra una sensibilidad notablemente reducida a la inmunidad humoral inducida por la vacuna en donantes sanos y, lo que es más importante, los individuos inmunocomprometidos ahora están casi completamente desprotegidos debido a su incapacidad de generar una respuesta inmune humoral protectora después de la vacunación33. Para estos individuos vulnerables, proponemos que la inmunización pasiva con 2 a 3 inyecciones por año con los mAbs P2G3 y P5C3 LS de vida media prolongada27 que pueden unirse simultáneamente a epítopos distintos y altamente conservados en el pico viral, podría representar una opción de profilaxis atractiva34. Con una potente neutralización, actividad funcional mediada por Fc y protección demostrada in vivo, esta combinación ampliamente activa, sujeta a un desarrollo y autorización exitosos, tiene el potencial de ser un cóctel de mAb anti-SARS-CoV-2 superior para intervenciones profilácticas y terapéuticas contra todos COV actuales, y su amplitud de actividad sugiere que podría ser capaz de neutralizar muchos COV futuros del SARS-CoV-2.

Las muestras de células mononucleares de suero y sangre procedieron de donantes que participaron en los estudios ImmunoCov e ImmunoVax realizados por el Servicio de Inmunología y Alergia del Hospital Universitario de Lausana, siendo todos los participantes adultos de diferentes edades y que habían firmado formularios de consentimiento informado para el uso de muestras biológicas. El diseño del estudio y el uso de muestras de sujetos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario de Lausana y la 'Commission d'éthique du Canton de Vaud' (CER-VD con números de referencia de ensayo 2020-00620 y 2021-00041, respectivamente).

Las mutaciones de pico del SARS-Cov-2 son similares para todas las variantes de pico clonadas y los aislamientos virales correspondientes, y se enumeran en la Tabla complementaria 2. Producción de las variantes 2019-nCoV (D614G), B.1.17, B.1.351 y P.1 ha sido descrita previamente21. El ARN aislado de una muestra sobrante anónima de un individuo sospechoso de estar infectado con la cepa Omicron del SARS-CoV-2 se transcribió de forma inversa en ADN complementario. El ectodominio de la espiga de Omicron se amplificó mediante PCR con cebadores (enumerados en la Tabla complementaria 3) diseñados en una secuencia consenso de las secuencias de Omicron disponibles y se introdujo mediante clonación por fusión en el plásmido nCoV-2P-F3CH2S, reemplazando la espiga de tipo salvaje original29. Las 2 prolinas (P986-P987) y las mutaciones del sitio de escisión de furina (residuos 682-685 mutados a GSAS) que estabilizan la proteína de pico en el estado de prefusión trimérica se introdujeron simultáneamente mediante PCR y mutagénesis dirigida al sitio mediada por infusión utilizando cebadores. enumerados en la Tabla complementaria 3 como se describió anteriormente 2, y se verificó la secuencia del marco de lectura abierto (ORF) completo de Omicron. El clon variante Delta B1.617.2 se generó mediante síntesis génica con un ORF de pico optimizado con codones (GenScript). Las construcciones finales codifican los ectodominios de espiga que contienen un péptido señal nativo, las mutaciones del sitio de escisión 2P y furina, un dominio de fusión plegable T4 C-terminal para estabilizar el complejo trímero, seguido de etiquetas C-terminal 8x His y 2x Strep para afinidad. purificación. Las variantes de picos triméricos se produjeron y purificaron como se describió anteriormente16. Se determinó que la pureza de los trímeros de picos de Omicron utilizados para crio-EM era >99 % mediante análisis SDS-PAGE. La biotinilación de proteínas Spike o RBD se realizó utilizando EZ-Link NHS-PEG4-biotina (Life Technologies) con un exceso molar de reactivo de 3 veces siguiendo el protocolo del fabricante. Las proteínas biotiniladas se intercambiaron en tampón con PBS usando un Amicon Ultra-0.5 con un límite de peso molecular de 3 kDa. Los tetrámeros Spike y RBD se prepararon frescos antes de su uso y se formaron combinando proteínas biotiniladas con estreptavidina conjugada con PE (BD Biosciences) en una proporción molar de 4:1.

Las perlas Luminex utilizadas para los ensayos de unión de anticuerpos serológicos y purificados se prepararon mediante acoplamiento covalente de proteínas del SARS-CoV-2 con perlas MagPlex utilizando un kit de acoplamiento de aminas Bio-Plex (Bio-Rad) siguiendo el protocolo del fabricante. Cada una de las proteínas de pico del SARS-CoV-2 expresadas con diferentes mutaciones se combinó con perlas MagPlex de diferentes colores para que las pruebas pudieran realizarse con una sola perla de proteína por pocillo o en un ensayo de unión Luminex multiplexado. Las curvas de unión para las mediciones de la afinidad de los anticuerpos y el ensayo de interacción pico-ACE2 se realizaron como se describió anteriormente16,35 utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG-PE humano (OneLambda ThermoFisher; H10104; dilución 1:100) para la detección de anticuerpos en el ensayo de unión de pico Luminex y anti -anticuerpo secundario IgG-PE de ratón (OneLambda ThermoFisher; P-21129; dilución 1:100) en el ensayo de neutralización sustituta de pico-ACE2. Los estudios de unión competitiva se realizaron preincubando 25 µg ml-1 del anticuerpo competidor indicado con las perlas Luminex originales acopladas a la proteína 2019-nCoV RBD durante 30 minutos. Se agregaron a cada pocillo anticuerpos biotinilados P5C3, P2G3, REGN10933, REGN10987, AZD8895, AZD1061, ADG-2 o S309 (preparados como se describe anteriormente) a 1 µg ml-1, seguido de una incubación adicional de 20 minutos. El anticuerpo biotinilado unido a RBD en presencia de un competidor se tiñó con estreptavidina-PE en una dilución 1:1000 (BD Biosciences) y se analizó en un instrumento 200 Bioplex. Se monitorearon muestras de suero de COVID-19 de más de 100 donantes para determinar los niveles de unión de anticuerpos IgG a las proteínas trímeras de pico del SARS-CoV-2 de las variantes 2019-nCoV, D614G, Alfa, Beta y Gamma en el ensayo basado en perlas Luminex.

La sangre de los donantes del estudio ImmunoVax se recogió en tubos con EDTA y el aislamiento de las células mononucleares sanguíneas se realizó utilizando tubos de centrífuga Leucosep (Greiner Bio-one) precargados con medio de gradiente de densidad (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. Las células recién aisladas se tiñeron con el cóctel de anticuerpos conjugados fluorescentes que contenía CD19 antihumano de ratón APC-Cy7 (BD Biosciences; 557791; clon SJ25C1; titulación de 5 µl), CD3-BV510 antihumano de ratón (BD Biosciences; 563109; cClone UCHT1 ; titulación de 1 µl), IgM-FITC antihumana de ratón (Biolegend; 314506; clon MHM-88; titulación de 2 µl), IgD antihumana de ratón PECF594 (BD Biosciences; 562540; clon IA6-2; titulación de 3 µl), Se utilizaron mAb CD27-APC antihumano de ratón (BD Biosciences; 558664; clon M-T271; titulación de 5 µl) y CD38-V450 antihumano de ratón (BD Biosciences; 646851; clon HB7; titulación de 5 µl) para antígeno B específico. -clasificación de células, junto con el tetrámero de pico variante Beta precomplejado (2 µg en 100 µl) acoplado a PE-estreptavidina (BD Biosciences; SA10044; relación molar 4:1). Todos los demás aspectos de la clasificación de células, el protocolo de inmortalización utilizando sobrenadantes positivos para el virus de Epstein Barr (EBV) de células B95-8 y la clonación fueron como se describe en Fenwick et al.21. Las secuencias de los mAb P2G3 y P5C3 se proporcionan en las presentaciones de PDB 7QTI, 7QTK y 7QTJ.

Todos los procedimientos de nivel 3 de bioseguridad fueron aprobados por la Oficina Federal Suiza de Salud Pública. El aislado de SARS-Cov-2 D614G y el clon B.1.1.7 han sido descritos previamente21. Los primeros aislados Beta (EPI_ISL_981782), Gamma (EPI_ISL_981707), Delta B1.617.2 (EPI_ISL_1811202) y Omicron B.1.1.529.1 (EPI_ISL_7605546) fueron un amable regalo de I. Eckerle, Hospital Universitario de Ginebra. Se prepararon reservas virales en medio EPISERF en células Vero E6 o Calu-3 (para Omicron), se dividieron en alícuotas, se congelaron y se titularon en células Vero E6.

El ensayo de neutralización se realizó como se describió anteriormente, excepto para los aislados Delta y Omicron donde se usó medio EPISERF en lugar de DMEM con FCS al 2% para preparar diluciones en serie de anticuerpos. Se utilizaron cantidades iguales de diferentes virus en todos los experimentos (1200 unidades formadoras de placas por pocillo), excepto en la cepa Omicron, menos citopática, donde se incubaron 2,5 veces más virus con cada anticuerpo probado en paralelo.

El día antes de la infección, se sembraron células 293T + ACE2 (± TMPRSS2) en placas de 6 pocillos recubiertas con polilisina a una densidad de 1 x 106 células por pocillo. Para generar una población viral bajo presión de mAb, el virus del paso temprano se diluyó en 1 ml de EPISERF con FCS al 2 % y se incubó con 0,25 ng ml-1 de mAb durante 1 h a 37 °C por duplicado. Cada mezcla se añadió a las células y los sobrenadantes P1 (pase 1) se recogieron 3 días después y se clarificaron en filtros SpinX de 0,45 um centrifugados a 4000 x g durante 4 minutos. Se diluyeron alícuotas de sobrenadantes de P1 eliminados 1:40 en DMEM al 2%, se incubaron con mAb como se describió anteriormente y se usaron para infectar células frescas durante 4 días. Los sobrenadantes de P2 se trataron como P1 y los sobrenadantes de P3 se recogieron para la extracción de ARN y el paso de selección posterior. Para seleccionar virus resistentes a mAb, se incubaron 100 µl de la población viral heterogénea P3 sin diluir con 100 µl de mAb a una concentración final de 2,5 µg ml-1, 0,625 µg ml-1 o 0,155 µg ml-1 durante 1 h a 37 °. C. Luego, la mezcla se aplicó sobre las células en 400 µl de DMEM al 2% (volumen 1:2) durante 3 a 4 días. Los virus se propagaron durante algunos pases más y se utilizaron alícuotas de cada pase para la extracción y secuenciación del ARN. El virus producido en ausencia de mAb se recogió y se trató de la misma manera en paralelo para controlar la aparición de mutaciones debidas a las condiciones del cultivo celular.

Se utilizó el plásmido HDM-IDTSpike-fixK (BEI, NR-52514; obtenido de JD Bloom, Fred Hutchinson Cancer Research Center) como columna vertebral para todas las clonaciones. Para los clones Alfa y Beta, los fragmentos HDM-IDTSpike-fixK NotI/SmaI se intercambiaron con los respectivos fragmentos Alfa y Beta de los plásmidos pTwist21 descritos anteriormente. Se agregaron además Alpha P681H, T716I, S982A, D1118H y Beta A701V en los respectivos ORF, así como R346K en el plásmido D614G mediante mutagénesis dirigida al sitio mediada por infusión utilizando los cebadores descritos en la Tabla complementaria 3. Se generó el clon Delta B1.617.2. mediante síntesis de genes con un ORF de pico optimizado con codones (GenScript). El ORF de Omicron se amplificó a partir de un ARN como se describe para la producción de proteínas, con los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 3. Alternativamente, se produjeron pseudovirus con el 2019-nCoV (100976), Alpha/B.1.1.7 (101023) y Beta/B originales. .1.351 (101024) Vectores de picos pCAGGS-SARS2 obtenidos de NIBSC. Estos vectores se cotransfectaron con los vectores pMDL p.RRE, pRSV.Rev y pUltra-Chili-Luc (Addgene) en células HEK 293T en medio DMEM + FCS al 10% usando Fugene 6 (Promega) para la producción de pseudovirus. Los ensayos de neutralización se realizaron como se describió anteriormente21.

En este estudio se utilizaron macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) originarios de centros de cría certificados por AAALAC de Mauricio. Todos los animales se alojaron en las instalaciones para animales IDMIT en CEA, Fontenay-aux-Roses bajo contención BSL-2 y BSL3 cuando fue necesario (autorización de instalación para animales n.° D92-032-02, Préfecture des Hauts de Seine, Francia) y de conformidad con la normativa europea. Directiva 2010/63/UE, la normativa francesa y las Normas para el cuidado humano y el uso de animales de laboratorio de la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio (OLAW, n.º de garantía A5826-01, EE. UU.). Los animales dieron negativo en Campylobacter, Yersinia, Shigella y Salmonella antes de ser utilizados en el estudio.

Los protocolos fueron aprobados por el comité de ética institucional 'Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives' (CEtEA no. 44) bajo la declaración número A20-011. El estudio fue autorizado por el 'Ministerio de Investigación, Innovación y Educación' con el número de registro APAFIS 24434-2020030216532863.

En el estudio de protección profiláctica, se asignaron aleatoriamente cuatro macacos cynomolgus hembras de entre 3 y 6 años de edad entre los grupos de control y tratado para evaluar la eficacia de P2G3 LS en la protección contra la exposición al virus SARS-CoV-2 Omicron BA.1. El grupo tratado (n = 2 (MF1 y MF2)) recibió una dosis de 10 mg kg-1 de anticuerpo monoclonal IgG1 humano P2G3 LS administrado mediante inyección intravenosa en bolo lento durante 3 a 8 minutos 3 días antes de la exposición, mientras que los animales de control (n = 2 en paralelo (MF3 y MF4)) y los animales históricos (n = 2 (MF5 y MF6)) no recibieron tratamiento. El número limitado de animales utilizados fue una primera evaluación exploratoria de la eficacia de P2G3 LS en el modelo NHP. En el estudio terapéutico, 16 macacos cynomolgus hembras de entre 3 y 6 años fueron asignadas aleatoriamente entre el control no tratado (n = 4), el 2,5 mg kg-1 P2G3 LS + 2,5 mg kg-1 P5C3 LS (n = 6) y el 5 mg kg-1 P2G3 LS + 5 mg kg-1 P5C3 LS (n = 6) grupos tratados para evaluar la eficacia de la combinación P2G3 LS/P5C3 LS en la supresión y eliminación del Omicron BA del SARS-CoV-2.1 virus. Luego, todos los animales fueron expuestos a una dosis total de 105 TCID50 del virus Omicron B.1.1.529 SARS-CoV-2 producido en células Calu-3 (referencia NIH/BEI: NR-56462) mediante la combinación de rutas intranasal e intratraqueal ( día 0 en el estudio profiláctico y 24 h en el estudio terapéutico), realizándose la recogida de muestras y las pruebas como se describió anteriormente36. Se realizaron hisopos traqueales, hisopos nasofaríngeos y lavados broncoalveolares en todos los NHP durante todo el estudio para monitorear los niveles de ARN genómico y subgenómico del virus SARS-CoV-2. Se realizó un enmascaramiento por el cual el técnico que analizaba las muestras para la titulación de ARN y virus no conocía los grupos de tratamiento que se estaban evaluando y todos los animales y puntos de datos se incluyeron en el análisis. El tamaño de la muestra de NHP se seleccionó sobre la base de la gran reducción de 1 a 2 log en el ARN viral anticipada en las muestras traqueales, nasofaríngeas y/o BAL, con una terapia eficaz que puede proporcionar diferencias estadísticamente significativas entre NHP tratados y no tratados. . Estas suposiciones sobre el tamaño de la muestra se confirmaron con las diferencias estadísticas observadas en los niveles de ARN viral evaluados mediante las pruebas bilaterales de Mann-Whitney para comparar los grupos de control y tratamiento.

El departamento de investigación y desarrollo de KU LEUVEN ha desarrollado y validado un modelo de infección del hámster dorado sirio por SARS-CoV-2 que es adecuado para la evaluación de la posible actividad antiviral de nuevos anticuerpos37,38,39. La cepa de SARS-CoV-2 utilizada en este estudio, BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020 (EPI ISL 109407976|2020-02-03), se recuperó de un hisopo nasofaríngeo tomado de un paciente asintomático confirmado por RT-qPCR que regresó de Wuhan, China, a principios de febrero de 2020. Mediante análisis filogenético se confirmó una estrecha relación con la cepa prototípica Wuhan-Hu-1 2019-nCoV (número de acceso 11 de GenBank, MN908947.3). El virus infeccioso se aisló mediante pases seriados en células HuH7 y Vero E637; Se utilizó el virus del paso 6 para el estudio descrito aquí. El título del stock de virus se determinó mediante dilución de punto final en células Vero E6 mediante el método de Reed y Muench. El trabajo relacionado con virus vivos se realizó en las instalaciones de alta contención A3 y BSL3+ del Instituto KU Leuven Rega (3CAPS) bajo las licencias AMV 30112018 SBB 219 2018 0892 y AMV 23102017 SBB 219 20170589 de acuerdo con las directrices institucionales.

El modelo de infección de hámster por SARS-CoV-2 ha sido descrito previamente37,39. Los animales fueron aclimatados durante 4 días antes del inicio del estudio. Las condiciones de alojamiento y los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de ética para la experimentación con animales de KU Leuven (licencia P065-2020). A hámsteres hembra (de 6 a 8 semanas de edad) se les administró control de isotipo IgG1 (5 mg kg-1), P2G3 LS (5 mg kg-1, 1 mg kg-1 o 0,5 mg kg-1) o REGN10933 (5 mg kg-1). 1) mediante inyección intraperitoneal. Dos días después, se anestesiaron los hámsteres con ketamina/xilazina/atropina, se recogieron muestras de sangre y se inocularon a los animales por vía intranasal con 2,4 × 106 mediana de TCID50 del SARS-CoV-2 (día 0). Se controló la apariencia, el comportamiento y el peso de los hámsteres. Las concentraciones de anticuerpos presentes en el plasma de hámster el día 0 del estudio se midieron usando el ensayo Luminex descrito anteriormente con perlas acopladas a trímeros de pico y usando anticuerpo P2G3 LS purificado para generar una curva estándar. En estos estudios, no se excluyeron animales de control. En los grupos tratados, se excluyeron de el análisis ya que éste indicó una falla técnica en la administración del medicamento. El día 4 después de la infección, se mataron los hámsteres y se homogeneizaron los tejidos pulmonares utilizando disrupción de cuentas (Precellys) en 350 µl de tampón de lisis TRK (kit de ARN total EZNA, Omega Bio-tek) y se centrifugaron (10.000 rpm, 5 min) para sedimentar la célula. escombros. El ARN se extrajo según las instrucciones del fabricante. De 50 µl de eluato, se utilizaron 4 µl como plantilla en reacciones de RT-qPCR. La RT-qPCR se realizó en una plataforma LightCycler96 (Roche) utilizando el kit RT-qPCR de un solo paso iTaq Universal Probes (Bio-Rad) con cebadores N2 y sondas dirigidas a la nucleocápside37. Se utilizaron estándares de ADNc (IDT) del SARS-CoV-2 para expresar copias del genoma viral por mg de tejido. Para las valoraciones de virus de criterio de valoración, los tejidos pulmonares se homogeneizaron mediante disrupción de cuentas (Precellys) en 350 µl de medio esencial mínimo y se centrifugaron (10.000 rpm, 5 min, 4 °C) para sedimentar los restos celulares. Para cuantificar las partículas infecciosas de SARS-CoV-2, se realizaron valoraciones de punto final en células Vero E6 confluentes en placas de 96 pocillos. Los títulos virales se calcularon mediante el método de Reed y Muench utilizando la calculadora Lindenbach y se expresaron como TCID50 por mg de tejido. El tamaño de la muestra de hámster se seleccionó sobre la base de la gran reducción >1 log en el ARN viral y el virus infeccioso anticipado en el tejido pulmonar con una terapia eficaz que puede proporcionar diferencias estadísticamente significativas entre los animales tratados y no tratados. Estos supuestos sobre el tamaño de la muestra se confirmaron en nuestro análisis estadístico. Las diferencias estadísticas en los niveles de ARN viral y la infectividad se evaluaron utilizando las pruebas bilaterales de Mann-Whitney para comparar los grupos de control y de tratamiento.

Los ensayos ADCC y ADCP se realizaron como se describió anteriormente con cambios menores40. Se descongelaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) criopreservadas de pacientes sanos y se resuspendieron a 1 millón ml-1 en medio RPMI (Gibco, Life Technologies) suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10%, 100 UI ml-1 de penicilina. y 100 µg ml-1 de estreptomicina (BioConcept). Las células se estimularon con 25 ng ml-1 de IL-15 (Miltenyi Biotec) durante 6 h y las células efectoras ADCC se enriquecieron a partir de PBMC mediante el agotamiento de las células T utilizando perlas magnéticas acopladas a anti-CD3 del kit de aislamiento de células T humanas EasySep ( Célula madre). Las células diana utilizadas para el ensayo ADCC fueron una línea celular resistente a CEM-NK que se transfectó de manera estable para expresar la proteína de pico 2019-nCoV original en la superficie celular y con expresión constitutiva del gen luciferasa (células CEM-NKR-Spike-Luc). . En el ensayo ADCC, las células CEM-NKR-Spike-Luc se incubaron con anticuerpo anti-spike a 0,3 µg ml-1, anticuerpos de control de isotipo a 0,3 µg ml-1 o un anticuerpo de control positivo anti-HLA clase I (MHC) ( Invivogen) a 0,005 µg ml-1. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, las mezclas de células/anticuerpos CEM-NKR-Spike-Luc se cocultivaron durante la noche en una proporción de 1:10 de células efectoras PBMC empobrecidas en CD3 en medio RPMI suplementado con 5% de FBS bajo en IgG y Penicilina-estreptomicina al 1% en placas de 96 pocillos con fondo en U (Sarstedt). Al día siguiente, se controló la muerte celular directamente mediante citometría de flujo o indirectamente mediante el control de la disminución de la actividad de la luciferasa asociada con la muerte celular. En el análisis de citometría de flujo, las células CEM-NKR-Luc transfectadas con púas se tiñeron con el kit PKH26 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma; MINI26-1KT) antes de realizar el ensayo ADCC. Para controlar la destrucción celular, las células cocultivadas se lavaron y se tiñeron con anticuerpos conjugados fluorescentes, CD56-AF488 antihumano de ratón (BD Biosciences; 557699; clon B159; titulación de 5 µl), CD16-FITC antihumano de ratón (BD Biosciences; 555406; clon 3G8; titulación de 2 µl) y CD4-PECF594 antihumano de ratón (BD Biosciences; 5562316; clon RPA-T4; titulación de 2 µl). Se utilizaron anexina V-APC (Invitrogen; 88-8102-72; titulación de 2 µl) y tinción de células vivas/muertas Aqua (Invitrogen; L34966; dilución 1:400) para las pruebas de validación de ADCC, y se utilizó anticuerpo anti-HLA clase I como control positivo (Invivogen; MA1-19027; clon W6/32; 20 ng ml-1) y luego las células se analizaron utilizando un citómetro FACS LSR II con el software Diva v6.1.2. Las células Spike CEM-NKR-Luc se controlaron con el fluorocromo PKH26 y luego se evaluaron las células muertas (Aqua positivas) y apoptóticas/moribundas (Anexina V positivas) para determinar si eran positivas (anti-HLA clase I), negativas (control de isotipo) y se probaron. (anticuerpos anti-pico) condiciones de anticuerpos para establecer la actividad ADCC. En el ensayo de lectura de luciferasa, las células cocultivadas se transfirieron a placas de 96 pocillos de Elmer blanco y la actividad de luciferasa se midió utilizando un kit de ensayo de luciferasa de un solo paso (BPS Biosciences) en un lector de placas Synergy. Las células CEM-NKR-Luc cocultivadas e incubadas con anticuerpos de control de isotipo generalmente dieron una señal de luminiscencia reducida entre un 5% y un 10% en comparación con las células CEM-NKR-Luc incubadas en ausencia de células efectoras. El anticuerpo anti-MHC (anti-HLA clase I) de control positivo produjo una fuerte destrucción celular dependiente de anticuerpos del 60% al 80% y los anticuerpos anti-picos dieron respuestas intermedias.

Para el ensayo ADCP, las microesferas modificadas con carboxilato TransFluoSpheres (1,0 µm de diámetro, excitación/emisión de 488 nm/560 nm; ThermoFisher) se acoplaron directamente con la proteína de pico trimérica 2019-nCoV o con estreptavidina según el protocolo del fabricante. Las perlas acopladas a picos se lavaron, se incubaron en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de anticuerpo anti-picos durante 30 minutos y luego la mezcla se añadió directamente a la línea celular de monocitos U937 sembrada en una placa de 96 pocillos con fondo en U (Sarstedt ). Después de una incubación durante la noche, las células se analizaron utilizando un citómetro FACS LSR II para identificar células con fluorescencia de perlas puntiagudas. Las células U937 incubadas con perlas de púas en ausencia de anticuerpo generalmente mostraron <5% de actividad fagocítica, mientras que se observó un aumento de la actividad ADCP con una concentración creciente de anticuerpo anti-púas, con un máximo del 100% de las células que exhibieron fluorescencia asociada con la fagocitosis de perlas de púas. La actividad ADCP de las perlas recubiertas con puntas de Omicron se midió preincubando perlas TransFluoSpheres acopladas con estreptavidina con proteína de punta Omicron biotinilada, producida como se describió anteriormente. Las perlas se lavaron después de 30 minutos y se usaron en el ensayo ADCP como se describe para las perlas triméricas de 2019-nCoV acopladas directamente.

Las rejillas Cryo-EM se prepararon con un Vitrobot Mark IV (ThermoFisher). Se descargaron rejillas de carbono con agujeros Quantifoil R1.2/1.3 Au 400 durante 120 s a 15 mA utilizando un dispositivo PELCO easiGlow (Ted Pella). Se aplicó una punta de Omicron (3,0 µl, 0,7 mg ml-1) mezclada con 0,16 mg ml-1 de cada uno de los fragmentos Fab de P5C3 y P2G3 (relación final de punta de Omicron de 3,2 uM: P5C3 de 1,5 uM: P2G3 de 1,5 uM) a la descarga luminosa. rejillas, se secaron durante 6 s con fuerza de transferencia 10 a 100% de humedad y 4 ° C en la cámara de muestra, y la rejilla borrada se congeló por inmersión en etano líquido enfriado con nitrógeno líquido.

Las rejillas se examinaron para determinar la presencia de partículas y la calidad del hielo en un microscopio TFS Glacios (200 kV), y las mejores rejillas se transfirieron a un TFS Titan Krios G4. Los datos de Cryo-EM se recopilaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión TFS Titan Krios G4, equipado con un Cold-FEG en un detector Falcon IV en modo de conteo de electrones. Las referencias de ganancia del Falcon IV se recopilaron justo antes de la recopilación de datos. Los datos se recopilaron utilizando TFS EPU v2.12.1 utilizando el protocolo de cambio de imagen sin aberraciones, registrando 4 micrografías por agujero en el hielo.

Las películas se grabaron con un aumento de ×165.000, correspondiente al tamaño de píxel de 0,83 Å en el nivel de la muestra, con valores de desenfoque que oscilaron entre −0,8 y −2,5 µm. Las exposiciones se ajustaron automáticamente a una dosis total de 60 e− Å−2, lo que resultó en un tiempo de exposición de aproximadamente 3 s por película. En total se recogieron 22.758 micrografías en formato EER.

El procesamiento sobre la marcha se realizó por primera vez durante la adquisición de datos para evaluar la calidad de los datos durante la selección mediante el uso de cryoSPARC live v3.3.141. Las estructuras ab-initio obtenidas se utilizaron para una mejor selección de partículas para la creación de plantillas. La corrección de movimiento se realizó en pilas sin procesar sin agrupamiento, utilizando la implementación de corrección de movimiento crioSPARC42. Las partículas (1.454.045) se seleccionaron automáticamente mediante plantilla. Se realizaron tres rondas de clasificación bidimensional (2D), lo que dio como resultado un conjunto de 383.541 partículas. Las partículas seleccionadas resultantes de la clasificación 2D se utilizaron para la reconstrucción ab-initio y el heterorefinamiento. Después del heterorefinamiento, 189.500 partículas contribuyeron a una reconstrucción 3D inicial con una resolución de 2,79 Å (coeficiente de capa de Fourier (FSC) 0,143) con simetría C1. Estas partículas fueron sometidas a una clasificación 3D dando como resultado 10 clases. La clase 9 dio como resultado un mapa global del pico Omicron con un RBD-up unido a un Fab P5C3 y P2G3 con una resolución de 3,04 Å (FSC 0,143) con simetría C1. El refinamiento enfocado de la Clase 4 con un volumen de máscara suave que abarca un RBD-up y su Fab vinculado y un RBD-down adyacente dio como resultado un mapa en 4.01 Å (FSC 0.143) con simetría C1. Finalmente, el refinamiento enfocado de la Clase 5 con un volumen de máscara suave que abarca un RBD-down y su P2G3 unido y un dominio N-terminal (NTD) adyacente dio como resultado un mapa en 3,84 Å (FSC 0,143) con simetría C1. Los volúmenes de máscara blanda se generaron manualmente en UCSF Chimera y cryoSPARC43.

Se instaló un modelo de trímero de pico (PDB ID 7QO7; https://www.rcsb.org/structure/7QO7) o modelos AlphaFold2 (implementación de ColabFold) de las Fabs P5C3 y P2G3 en los mapas crio-EM con UCSF Chimera. Estos modelos acoplados se ampliaron y reconstruyeron manualmente con refinamiento, utilizando Coot y Phenix44,45. Las figuras se prepararon en UCSF Chimera, UCSF ChimeraX y Pymol43. La numeración de los modelos de picos de longitud completa dentro del mapa global se basa en la numeración de Omicron. La numeración de modelos que contienen solo el RBD dentro de los mapas locales se basa en una numeración de tipo salvaje. Numeración Fab en uno de los primeros dominios constantes para las cadenas pesada (CH1) y ligera (CL), respectivamente. Las mediciones del área de superficie enterrada y las mediciones del centroide se calcularon dentro de ChimeraX.

Los parámetros estadísticos, incluidos los valores exactos de n, la definición de centro, dispersión y medidas de precisión (media o mediana ± sem) y la significación estadística, se informan en las figuras y sus leyendas. Se consideró que los datos eran estadísticamente significativos cuando P < 0,05. En las figuras, los asteriscos denotan significación estadística calculada utilizando la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica de dos colas para comparaciones de dos grupos o la prueba de Kruskal-Wallis con la corrección de comparación múltiple de Dunn. Los análisis se realizaron en GraphPad Prism y Microsoft Excel.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y en los datos fuente. Los mapas reconstruidos del pico global de Omicron con Fabs unidos están disponibles en la base de datos EMDB, simetría C1, EMDB-14141. El modelo atómico para el pico Omicron de longitud completa con Fabs unidos está disponible en la base de datos PDB, PDB-7QTI. El mapa de refinamiento enfocado local del RBD-up con dos Fabs enlazados está disponible en la base de datos EMDB, EMDB-14142. El modelo atómico para RBD-up con dos Fabs vinculados en el mapa refinado localmente está disponible en la base de datos PDB, PDB-7QTJ. El mapa de refinamiento enfocado local del RBD-down con P2G3 Fab enlazado está disponible en la base de datos EMDB, EMDB-14143. El modelo atómico para RBD-down con P2G3 Fab vinculado en el mapa refinado localmente está disponible en la base de datos PDB, PDB-7QTK. Todos los plásmidos elaborados en este estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Liebschner, D. y col. Determinación de la estructura macromolecular mediante rayos X, neutrones y electrones: desarrollos recientes en Phenix. Acta Crystallogr. D 75, 861–877 (2019).

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Agradecemos al Servicio de Inmunología y Alergia del Hospital Universitario de Lausana por el análisis de muestras de suero para determinar los niveles de anticuerpos IgG contra la proteína pico; I. Eckerle, M. Bekliz y el laboratorio de Virología del Hospital Universitario de Ginebra para la recolección de muestras de ARN de Omicron y aislados variantes; el Centro del Genoma de Ginebra para la secuenciación y J. Duc para el desarrollo de guiones internos para análisis; L. Durrer, R. Schier, M. François y S. Quinche de la Instalación central de estructura y producción de proteínas de la EPFL para la producción de células de mamíferos y la purificación de proteínas; A. Myasnikov, B. Beckert y S. Nazarov del Dubochet Center for Imaging (una iniciativa de EPFL, UNIGE, UNIL) para la preparación de redes crio-EM y la recopilación de datos, y D. Demurtas para la configuración de las condiciones crio-EM para sistemas automatizados. adquisición en estudios relacionados no incluidos en este manuscrito; D. Wyatt y miembros del equipo del paquete de trabajo 4 de CARE-IMI por sus útiles debates. GP y RL recibieron una subvención del proyecto Corona Accelerated R&D in Europe (CARE), financiado por la Empresa Conjunta (JU) Innovative Medicines Initiative 2 en virtud del acuerdo de subvención no. 101005077. La JU recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, la Federación Europea de Asociaciones de Industrias Farmacéuticas (EFPIA), la Fundación Bill y Melinda Gates, el Global Health Drug Discovery Institute y la Universidad de Dundee. El contenido de esta publicación sólo refleja la opinión de los autores y la JU no es responsable del uso que pueda hacerse de la información que contiene. Se proporcionó financiación adicional a través del Hospital Universitario de Lausana (a GP), el Instituto Suizo de Investigación de Vacunas (a GP y NCCR TransCure a HS), CARIGEST SA (a DT y GP), subvenciones de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (a GP) y a través de el fondo EPFL COVID (al DT).

Estos autores contribuyeron igualmente: Craig Fenwick, Priscilla Turelli, Dongchun Ni, Laurent Perez.

Servicio de Inmunología y Alergia, Departamento de Medicina, Hospital Universitario de Lausana y Universidad de Lausana, Lausana, Suiza

Craig Fenwick, Laurent Perez, Erica Lana, Céline Pellaton, Line Esteves-Leuenberger, Jérémy Campos, Alex Farina, Flurin Fiscalini & Giuseppe Pantaleo

Facultad de Ciencias de la Vida, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suiza

Priscilla Turelli, Kelvin Lau, Charlène Raclot, Florence Pojer y Didier Trono

Facultad de Ciencias Básicas, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne y Facultad de Biología y Medicina, UNIL, Lausanne, Suiza

Dongchun Ni y Henning Stahlberg

CEA, Universidad de Paris Sud 11, INSERM U1184, Centro de Inmunología de Infecciones Virales y Enfermedades Autoinmunes, Departamento IDMIT, IBFJ, Fontenay-aux-Roses, Francia

Cecile Herate, Roman Marlin, Nathalie Dereuddre-Bosquet, Francis Relouzat y Roger LeGrand

KU Leuven Departamento de Microbiología, Inmunología y Trasplantes, Instituto Rega de Investigación Médica, Laboratorio de Virología y Quimioterapia, Lovaina, Bélgica

Rana Abdelnabi, Caroline S. Foo, Johan Neyts y Pieter Leyssen

VRI, Universidad Paris-Est Créteil, Facultad de Medicina, INSERM U955, Créteil, Francia

Yves Levy

Inserm U955, Equipo 16, Créteil, Francia

Yves Levy

AP-HP, Hospital Henri-Mondor Albert-Chenevier, Departamento de Inmunología Clínica y Enfermedades Infecciosas, Créteil, Francia

Yves Levy

Instituto Suizo de Investigación sobre Vacunas, Hospital Universitario de Lausana y Universidad de Lausana, Lausana, Suiza

Giuseppe Pantaleo

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CF diseñó la estrategia para aislar y perfilar anticuerpos anti-spike, diseñó los ensayos funcionales, coordinó las actividades de investigación, analizó los datos, escribió el borrador inicial y contribuyó a la edición del manuscrito. PT estableció y realizó los experimentos con el ensayo de neutralización del efecto citopático del virus vivo SARS-CoV-2, diseñó y probó las mutaciones de la proteína de pico y la clonación con la ayuda de CR, analizó los resultados y contribuyó a la edición del manuscrito. LP, DN, KL, FP y HS coordinaron el análisis crio-EM, analizaron los datos estructurales, escribieron la sección estructural del manuscrito y contribuyeron a la edición del manuscrito. Otros autores contribuyeron de la siguiente manera: LE-L. realizó estudios de clasificación, inmortalización, unión de células B y ensayos funcionales de mAb; AF y EL realizaron la clonación de mAb VH y HL; JC realizó estudios de unión, producción de lentivirus seleccionados y ensayos pseudovirales; CP realizó la caracterización in vitro de anticuerpos séricos de muestras de donantes; FF realizó la purificación de mAb, la caracterización de mAb y la biología molecular; CR realizó mutagénesis dirigida al sitio de las construcciones de picos; FP coordinó la producción de proteína de pico recombinante y mAb. PL, YL y RL diseñaron los estudios in vivo, que fueron ejecutados por CH, RM, ND-B., FR, RA, CSF y JNGP y DT concibieron el diseño del estudio, analizaron los resultados y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Didier Trono o Giuseppe Pantaleo.

CF, GP, PT y DT son coinventores de una solicitud de patente que abarca los anticuerpos y los datos descritos en este manuscrito (EP 22153464.7 y PCT/IB2022/050731). DT y GP se encuentran entre los fundadores y el capital propio de Aerium Therapeutics, que tiene los derechos y persigue el desarrollo de los anticuerpos descritos en la publicación, y tiene acuerdos de investigación patrocinados con el Hospital Universitario de Lausana (CHUV) y la Ecole Polytechnique Fédérale. de Lausana (EPFL). Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a) Curvas de unión de Spike (n = 2) y b) Estudios de unión competitiva entre anticuerpos que se unen a la proteína Spike RBD de 2019-nCoV. Se utilizaron perlas acopladas a RBD preincubadas con concentraciones saturadas de anticuerpo competidor para estudios de unión con mAb o ACE2. Los competidores indujeron un bloqueo fuerte (cuadros rojos), una competencia parcial (cuadros naranjas) o una unión no competitiva (cuadros blancos) con el mAb correspondiente a RBD. Las líneas discontinuas rojas y amarillas indican un bloqueo incompleto de la interacción Spike-ACE2 con las proteínas variantes Alpha, Gamma y Omicron Spike (n = 2 para cada curva de mAb y proteínas Spike). c) actividad de bloqueo de Spike-ACE2 de un panel de mAb anti-Spike internos, autorizados y clínicamente avanzados y d) mapa de calor que muestra los valores de IC50, IC80 e Imax para nuestro panel de mAb en el ensayo Spike-ACE2. Estos ensayos basados ​​en Luminex se realizaron con perlas acopladas con proteínas trímeras Spike de las variantes preocupantes originales 2019-nCoV, mutante D614G, Alfa, Beta, Gamma y Omicron SARS-CoV-2. Sotrovimab se incluyó como mAb de control que se une al RBD sin bloquear la interacción Spike-ACE2. e) Datos representativos de la actividad de bloqueo de Spike-ACE2 y la unión de Spike para mAb P2G3 y P5C3 utilizando las mismas perlas Luminex recubiertas con trímero Omicron BA.2 Spike. Las réplicas mostradas para P2G3 y P5C3 son n = 8 y 7 en el ensayo Spike-ACE2 y n = 4 y 2 en el ensayo de unión de Spike, respectivamente. Se muestran los valores medios ± SEM.

Datos fuente

Neutralización de partículas lentivirales pseudotipadas con: a) Spike del SARS-CoV-2 que codifica la mutación R346K y la sustitución D614G que se volvió dominante al principio de la pandemia y b) Omicron BA1.1 con la sustitución R346K en un ensayo de infección 293T-ACE2. Los paneles a y b representan triplicados de todos los mAb probados con la excepción de AZD8895 y AZD1061 que se probaron como duplicados en a. c) P2G3 evaluado en ensayos de neutralización del efecto citopático de virus vivos con las variantes preocupantes originales 2019-nCoV y Alpha, Beta, Gamma, Delta y Omicron BA.1 con n = 6, 4, 4, 4, 6 y 6 réplicas mostradas, respectivamente. Se muestran los valores medios ± SEM.

Datos fuente

a) Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) realizado con células CEM NKR Luciferase que expresan de manera estable 2019-nCoV Spike en la superficie celular. P2G3 exhibe una potente actividad ADCC para matar células positivas para Spike. Los experimentos de ADCC se realizaron con cinco réplicas por condición utilizando células efectoras de cinco donantes sanos diferentes y cada donante se evaluó en uno a tres experimentos diferentes (n = 50 pruebas por condición). Se incubaron células CEM NKR Spike con 0,30 µg/ml de los mAb IgG humanos indicados. Los gráficos de violín se muestran con valores medianos como una línea media gruesa y cuariles para las líneas superior e inferior. Diferencia estadística evaluada mediante ANOVA de dos vías con valores de p presentados como p = 0,0096 (**), p = 0,0001 y 0,0002 (de izquierda a derecha ***) y p < 0,0001 (****). b) Estrategia de activación de citometría de flujo para la selección de células U937, la eliminación de dobletes celulares y la evaluación de células para las cuales las perlas fluorescentes recubiertas de Spike se han sometido a fagocitosis. La puerta de umbral para la fagocitosis de perlas específica de Spike se estableció utilizando un anticuerpo de control de isótopos y se muestran diagramas de puntos representativos para ADCP mediado por P2G3 de perlas recubiertas de Spike de 2019-nCoV por U937 con >4000 células analizadas por condición. c, d) Ensayo de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos realizado con 2019-nCoV ancestral y con proteína Spike variante Omicron BA.1 biotinilada y unida a perlas fluorescentes recubiertas de estreptavidina. Las perlas mezcladas con las concentraciones de anticuerpo indicadas se incubaron con la línea celular efectora de monocitos U937 y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos de las perlas recubiertas con Spike se evaluó mediante citometría de flujo. Las líneas discontinuas corresponden a anticuerpos individuales y las líneas continuas indican combinaciones de P2G3 y P5C3. Los resultados mostrados son datos representativos de tres experimentos separados con cada respuesta de concentración probada por duplicado o triplicado. Se muestran los valores medios ± SEM.

Datos fuente

a) Descripción general del diseño del estudio para el modelo de exposición al hámster SARS-CoV-2. A los animales se les administró por vía intraperitoneal 5,0, 1,0 o 0,5 mgkg-1 de P2G3, 5 mg/kg de control positivo REGN10933 o 5 mg/kg de un control de isotipo IgG1 y se expusieron dos días después (día 0) a una inoculación intranasal del original 2019. -Virus nCoV SARS-CoV-2 (2,4 × 106 TCID50). b) Los niveles medios de virus infeccioso yc) copias de ARN viral/mg de tejido pulmonar en cada uno de los brazos del estudio se muestran el día 4 después de la inoculación con el virus SARS-CoV-2. Los brazos de tratamiento para el control de IgG, REGN10933 5 mg/kg, P2G3 5 mg/kg, P2G3 1,0 mg/kg y P2G3 0,5 mg/kg constan de n = 6, 5, 4, 5 y 6 hámsteres, respectivamente. Se utilizaron pruebas no paramétricas U de Mann-Whitney de dos colas para evaluar la diferencia estadística entre las condiciones de tratamiento con p = 0,0043, 0,0095, 0,0043 y 0,0022 (de izquierda a derecha, **) en b y p = 0,0043, 0,0095. , 0,0043 y 0,0022 (de izquierda a derecha, **) en c.

Datos fuente

Flujo de trabajo de procesamiento Cryo-EM realizado en CryoSPARC v.3.3.1.

a) La micrografía representativa representa una de un total de 22 758 micrografías (consulte la Tabla 1) tomadas de 1 cuadrícula. b) Promedios representativos de clases 2D. c) Clase 2D ampliada que muestra Omicron Spike con Fabs encuadernados. d) Gráfico de distribución de dirección y curvas FSC que indican una resolución de 3,04 Å (FSC 0,143) del mapa Global (Clase 9) del Omicron Spike de longitud completa unido a Fabs. e) Gráfico de distribución de dirección y curvas FSC que indican una resolución de 3,84 Å (FSC 0,143) del mapa refinado localmente con P2G3-RBD-down (Clase 5) f) Gráfico de distribución de dirección y curvas FSC que indican una resolución de 4,01 Å (FSC 0.143) del mapa refinado localmente P5C3-P2G3-bound-RBD-up (Clase 4). Mapas refinados globales y enfocados coloreados por resolución local.

a) La superficie enterrada de P5C3 (rosa) superpuesta a la superficie de RBD (verde). P5C3 entierra alrededor de 500 Å de la superficie del Omicron RBD. Se indican bucles CDR específicos de las cadenas pesada y ligera. Las mutaciones de Omicrón se muestran como bolas y palos y superficies transparentes en amarillo. b) Vista ampliada de la región de interacción de P2G3. Se indican bucles CDR específicos de las cadenas pesada y ligera. Las mutaciones de Omicrón en la región de Fab están resaltadas en amarillo. Los residuos del Fab que interactúan se muestran como barras. c) Análisis detallado a nivel atómico de las interacciones entre Omicron RBD que se muestra como cintas (verde) y las cadenas pesadas y ligeras de P5C3 Fab que se muestran como regaliz (rojo oscuro y rosa). Los residuos en la interfaz se muestran como barras con posibles interacciones de interés como líneas discontinuas. Las mutaciones ómicras se muestran en amarillo. d) Superposición de la interfaz P5C3-Omicron-RBD con la interfaz P5C3-wild-type-RBD (PDB; 7PHG).

a) La superficie enterrada de P2G3 (gris) superpuesta a la superficie de RBD (verde). P2G3 entierra 705 Å de la superficie del Omicron RBD. Se indican bucles CDR específicos de las cadenas pesada y ligera. Las mutaciones de Omicrón se muestran como bolas y palos y superficies transparentes en amarillo. b) Representación en barra de la interfaz P2G3 de CDRH3 y la región RBD que contiene los residuos 440-451. La malla representa la densidad Cryo-EM. c) La superposición de la interfaz P2G3-RBD-up con la interfaz P2G3-RBD-down no muestra diferencias significativas con las interacciones conservadas. d) Unión de P2G3 Fabs al dominio RBD-arriba en verde y al dominio RBD-abajo en naranja dentro del Spike trimérico. e) Representación en barra de la interfaz P2G3 del residuo W53 de CDRH2 que forma una posible interacción catión-pi con el residuo R346 de RBD. La malla representa la densidad Cryo-EM.

Modelo de Fabs para anticuerpos de Clase 3, REGN10987, AZD1061 y S309/Sotrovimab que se unen a cada uno de los protómeros de RBD para el trímero Omicron completo. Los trímeros se muestran desde múltiples perspectivas para visualizar los diferentes ángulos de ataque que tienen los Fabs dependiendo del protómero Spike. a) REGN10987 Fab se une a la conformación verde RBD-up, pero el REGN10987 Fab modelado unido al RBD-down del protómero naranja o azul chocaría estéricamente con los protómeros adyacentes azul RBD-down o verde RBD-up, respectivamente. En conjunto, se predice que REGN10987 solo puede unirse a RBD-up. b) Se predice que AZD1061 se unirá a la forma RBD-arriba y a la forma RBD-abajo del protómero azul, pero la unión modelada por Fab de AZD1061 al RBD-abajo del protómero naranja potencialmente chocaría con el RBD-arriba verde adyacente. c) S309/Sotrovimab puede unirse a todos los RBD simultáneamente como se muestra para P2G3. d) El ángulo de ataque de los Fab al RBD se define como la línea que conecta el centroide del Fab con el centroide de la superficie del RBD que entierran los Fab.

Neutralización de partículas lentivirales pseudotipadas con la variante Delta del SARS-CoV-2 Spike que codifica: a) la sustitución de K444T Spike con escape de P2G3 y b) G476D c) F486S, d) N487K y e) sustituciones de N487D Spike con escape de P5C3. Los resultados mostrados consisten en n = 6 réplicas para P2G3 y P2G3 + P5C3, n = 5 o 6 réplicas para P5C3 y la mezcla AZD y n = 3–5 réplicas para Sotrovimab. Se muestran los valores medios ± SEM.

Datos fuente

Higos suplementarios. 1 y 2, y Tablas 1 a 3.

Datos de origen para la detección de ARN subgenómico en el estudio de eficacia terapéutica del NHP.

Fuente de datos para generar curvas de inhibición para bloquear la interacción pico-ACE2.

Fuente de datos para ensayos de neutralización del efecto citopático de virus vivos y pseudovirales.

Fuente de datos para el ARN genómico y subgenómico viral en el estudio de desafío NHP.

Fuente de datos para el ARN genómico y subgenómico viral en el estudio de eficacia terapéutica del NHP.

Datos fuente para la caracterización de mutaciones de escape viral.

Fuente de datos para ensayos de actividad de bloqueo de pico-ACE2 y unión de picos.

Fuente de datos para ensayos de neutralización de virus vivos y pseudovirales.

Datos de origen para ensayos funcionales mediados por ADCC y ADCP Fc.

Fuente de datos para la detección de virus infecciosos y ARN viral en el modelo de desafío de hámster.

Datos de origen para ensayos de neutralización pseudoviral realizados con picos que codifican mutaciones de escape P2G3 y P5C3.

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Fenwick, C., Turelli, P., Ni, D. et al. El anticuerpo monoclonal derivado del paciente neutraliza las variantes Omicron del SARS-CoV-2 y confiere protección total en los monos. Nat Microbiol 7, 1376-1389 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01198-6

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Recibido: 08 de junio de 2022

Aceptado: 06 de julio de 2022

Publicado: 25 de julio de 2022

Fecha de emisión: septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01198-6

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