Extracto de propóleo egipcio para la funcionalización de hidrogel poroso de nanofibras de celulosa/alcohol polivinílico junto con caracterización y aplicaciones biológicas.

Jun 27, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 7739 (2023) Citar este artículo

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El propóleo de abeja es uno de los extractos naturales más comunes y ha despertado gran interés en la biomedicina debido a su alto contenido en ácidos fenólicos y flavonoides, responsables de la actividad antioxidante de los productos naturales. El presente estudio informa que el extracto de propóleo (PE) fue producido por etanol en el ambiente circundante. El PE obtenido se añadió en diferentes concentraciones a nanofibras de celulosa (CNF)/poli(alcohol vinílico) (PVA) y se sometió a métodos de congelación, descongelación y liofilización para desarrollar matrices bioactivas porosas. Las observaciones con microscopio electrónico de barrido (SEM) mostraron que las muestras preparadas tenían una estructura porosa interconectada con tamaños de poro en el rango de 10 a 100 μm. Los resultados de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de PE mostraron alrededor de 18 compuestos polifenólicos, con las cantidades más altas de hesperetina (183,7 µg/mL), ácido clorogénico (96,9 µg/mL) y ácido cafeico (90,2 µg/mL). Los resultados de la actividad antibacteriana indicaron que tanto los hidrogeles PE como los funcionalizados con PE exhibieron efectos antimicrobianos potenciales contra Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans y Candida albicans. Los experimentos de cultivo celular de prueba in vitro indicaron que las células de los hidrogeles funcionalizados con PE tenían la mayor viabilidad, adhesión y diseminación de las células. En conjunto, estos datos resaltan el interesante efecto de la biofuncionalización del propóleo para mejorar las características biológicas del hidrogel CNF/PVA como matriz funcional para aplicaciones biomédicas.

La aplicación más pronunciada de materiales biocompatibles similares a tejidos tridimensionales (3D) es dirigir la regeneración o curación del tejido después de un daño. Esto se basa en la capacidad de estos materiales para optimizar el microambiente fisiológico mediante el uso de señales bioquímicas, biofísicas y, a veces, estimulación mecánica para mejorar la función celular1,2. De hecho, los materiales bioactivos desempeñan múltiples funciones destacadas a la hora de desencadenar la proliferación y diferenciación celular, además de minimizar la respuesta inflamatoria que puede retrasar el proceso de curación3,4. Los hidrogeles son biomateriales inteligentes que pueden aplicarse para la curación de una variedad de tejidos, como la piel, el cartílago, los huesos y los vasos sanguíneos5. Pueden proporcionar una estructura óptima (3D) similar a la matriz extracelular nativa (ECM) y permitir la difusión de gases, nutrientes y desechos a través de las redes elásticas reticuladas6. Durante las últimas décadas, se han utilizado una variedad de materiales poliméricos de origen natural o sintético para desarrollar hidrogeles funcionales. Los hidrogeles reforzados con fibras son una clase de hidrogeles compuestos en los que las redes de gel generalmente están reforzadas con estructuras de fibras para mejorar el rendimiento mecánico y también limitar el comportamiento de hinchamiento7,8,9.

La celulosa es el polímero de origen natural más abundante en la Tierra, es el componente principal de las paredes celulares de las plantas y de algunas células animales10. Es un homopolisacárido lineal que consta de unidades de β-d-anhidroglucopiranosa, unidas por enlaces éter β (1→4) (enlaces glicosídicos). Las cadenas de celulosa formadas están unidas por enlaces de hidrógeno para formar fibrillas que constan de regiones amorfas y cristalinas. CNF significa una clase específica de nanocelulosas que se componen de dominios amorfos y altamente ordenados asociados alternativamente y generalmente se obtienen mediante la desintegración mecánica de fibrillas de celulosa11,12. Como resultado, CNF ha estado surgiendo biomateriales de tamaño nanométrico que muestran una gran resistencia, área de superficie y química de superficie ajustable, lo que permite interacciones controladas con polímeros, nanopartículas, moléculas pequeñas y materiales biológicos. Por ejemplo, se incorporó CNF en una solución de alginato y alcohol polivinílico para formar un hidrogel estable que promueve la mineralización in situ de fosfatos de calcio13. Además, se injertó CNF oxidado con 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo (TEMPO), que tiene grupos carboxilo, mediante hidrolizado de proteína de soja mediante amidación de grupos carboxílicos. El CNF injertado ayudó a la mineralización de hidroxiapatita a partir de fluido corporal simulado dos veces para formar un nuevo material bioactivo14.

Uno de los polímeros hidrófilos utilizados para producir hidrogeles sintéticos biocompatibles es el PVA, un polímero semicristalino. El hidrogel de PVA se puede reticular físicamente para producir materiales biocompatibles porosos con microestructura y propiedades de deformación comparables a las membranas biológicas, lo que los hace ideales para aplicaciones biomédicas15,16. La reticulación física del PVA se puede realizar mediante ciclos repetidos de congelación y descongelación. En este método, la solución de PVA preparada se congela, lo que permite que se formen cristales de hielo que empujan las cadenas de PVA y las empaquetan en espacios reducidos. La cristalización del polímero ocurre en estas regiones. Luego, a través del proceso de descongelación, los cristales de hielo se derriten, formando criogeles porosos con cristales que funcionan como uniones entrecruzadas17. Aunque los hidrogeles tradicionales poseen excelentes propiedades como seguridad, biocompatibilidad y mayor hidrofilicidad, tienen un rendimiento biológico limitado. Hoy en día, la combinación de hidrogel con agentes terapéuticos (es decir, fármacos, extractos naturales, proteínas funcionales o genes) representa un método eficaz para ofrecer ambientes más favorables para el proceso de regeneración de tejidos y evitar el rápido metabolismo de los agentes terapéuticos18.

El propóleo es un subproducto natural de la apicultura que se ha utilizado para curar heridas desde la antigüedad. Más de 300 compuestos están presentes en el propóleo y el color varía según la vegetación de la región y la fuente vegetal. Dependiendo de la vegetación regional, puede ser de color verde amarillento o marrón oscuro19. Además de proteger las grietas de las colmenas, el propóleo fortalece las células del panal y protege las colmenas de las invasiones microbianas20. Los principales componentes polifenólicos del propóleo son los flavonoides y los ésteres de ácidos fenólicos, seguidos de los ácidos aromáticos, los lignanos y los terpenoides21. Normalmente, la cera de abeja constituye el 30% de la mezcla, el polen el 5% y las resinas y bálsamos vegetales el 50%21. Además de sustancias balsámicas, resinosas y gomosas, el propóleo también contiene polen, saliva y cera, y las abejas melíferas lo obtienen de los exudados y brotes de las plantas22.

Las propiedades antimicrobianas del propóleo se atribuyen a los flavonoides, que son eficaces contra bacterias Gram positivas y Gram negativas23. Muchas propiedades biológicas están asociadas con el propóleo, incluidas propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antiinflamatorias, anticancerígenas y antitumorales24,25. Se han aplicado materiales a base de propóleo como materiales para la cicatrización de heridas. Por ejemplo, el propóleo en forma de crema se utiliza para mejorar la cicatrización del tejido dérmico y reducir la inflamación de la herida mejor que la sulfadiazina de plata26. Promueve la proliferación, activación y capacidad de crecimiento de las células de la piel, sin toxicidad ni reacciones alérgicas.

Recientemente, los hidrogeles funcionales han atraído una gran atención para aplicaciones de ingeniería y regeneración de tejidos debido a su hidrofilicidad, flexibilidad y potencial adhesivo inherente a los tejidos biológicos. Estas características distintivas desempeñan un papel fundamental en el aumento del tiempo de residencia de un ingrediente terapéutico determinado en contacto directo con su objetivo biológico. Por lo tanto, el presente estudio tiene como objetivo preparar un hidrogel 3D a partir de PVA y CNF utilizando ciclos repetidos de congelación y descongelación, como un hidrogel físicamente reticulado seguro para una combinación efectiva de PE sin interacciones secundarias no deseadas con reticulantes que participan en procesos químicamente cruzados. -hidrogeles enlazados. Las características de la microestructura de los hidrogeles cargados de PE se analizaron mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), SEM y difracción de rayos X (XRD). Además, se determinó la viabilidad de las células de prueba in vitro y la unión a células de fibroblastos humanos normales (HFB4). Finalmente, también se investigaron los potenciales antibacterianos y antiinflamatorios, como se resume en la Fig. 1.

Representación esquemática de los cinco pasos principales del trabajo actual: (A) extracto de propóleo; (B) Preparación de CNF a base de bagazo blanqueado; (C) CNF/PVA cargado con PE; (D) caracterización de la microestructura de las muestras obtenidas; y (D) aplicaciones biológicas.

La composición química del PE puede variar según la fuente de alimento de las abejas. Por tanto, es importante ilustrar la composición química del PE para enfatizar la presencia o ausencia de ciertos compuestos. Como se muestra en la Tabla 1 y la Fig. 2, el método de detección por HPLC pudo identificar 18 compuestos polifenólicos en PE, que desempeñan funciones extremadamente importantes en su actividad biológica. Los compuestos polifenólicos con mayor contenido ilustrado en PE fueron hesperetina (183,73 µg/mL), ácido clorogénico (96,92 µg/mL), ácido cafeico (90,28 µg/mL), daidzeína (67,89 µg/mL) y apigenina (66,59 µg/mL). ). Mientras que la rutina y la vainillina tuvieron concentraciones bajas de 0,8 y 0,7 µg/mL, respectivamente. Por otro lado, la única catequina no observada en el PE en comparación con el estándar. El origen geográfico y el disolvente de extracción del propóleo son los principales factores que afectan la disponibilidad y las concentraciones de compuestos polifenólicos, como se ilustra en la Tabla 2.

Huella digital HPLC de PE.

Para la oxidación selectiva de grupos hidroxilo primarios en celulosa (Fig. 3A), la oxidación mediada por TEMPO es un método adecuado para que la oxidación C-6 genere grupos carboxílicos reactivos. La Figura 3B muestra el espectro FT-IR de CNF, que exhibe los picos característicos de las cadenas de celulosa35. Sin embargo, se observó una nueva banda a 1739 cm-1 que se atribuyó al estiramiento de los grupos carbonilo (C=O), debido al proceso de oxidación TEMPO. El CNF preparado se confirmó mediante el patrón XRD informado en la Fig. 3C. Muestra dos picos de difracción principales a 16,4° (110) y 23,1° (200) que son característicos de la celulosa nativa. Además, el porcentaje de cristalinidad se estimó según el método de Segal y registró ~73%36. La estructura interna de CNF también se examinó mediante análisis con microscopio electrónico de transmisión (TEM). La Figura 3D mostró CNF con una longitud micrométrica y un diámetro que varía de 4 a 20 nm, calculado mediante análisis de imágenes. Además, las nanofibras exhibieron una estructura uniforme debido a la formación homogénea de grupos carboxilato en la superficie de las fibras.

Análisis químico de materiales celulósicos (A) FT-IR de celulosa, (B) FT-IR de CNF, (C) XRD de CNF y (D) imagen TEM de CNF.

De hecho, los hidrogeles poliméricos se fabrican mediante reticulación física o química, o incluso ambas. Los hidrogeles físicamente reticulados se obtienen mediante interacciones débiles, mientras que los enlaces covalentes químicos se forman cuando los hidrogeles se reticulan químicamente. Entre ellos, los hidrogeles de PVA se pueden formar simplemente mediante la técnica de congelación y descongelación. En este estudio, se prepararon hidrogeles cargados de PE basados ​​en CNF y PVA mediante reticulación física simple después de ciclos sucesivos de congelación y descongelación seguidos de liofilización para producir estructuras porosas en 3D. La Figura 4A-C ilustra imágenes SEM de las superficies de los hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2, junto con las imágenes de sección transversal para la misma muestra de hidrogel. La Figura 4D muestra las imágenes de la sección transversal de los mismos hidrogeles. Las imágenes de sección transversal y superficie confirman la formación de estructuras porosas rugosas interconectadas en 3D con poros irregulares que varían en tamaño de 10: 100 µm. Esta estructura microporosa es muy importante para el reclutamiento celular porque facilita el transporte de oxígeno y nutrientes. La introducción de PE en el hidrogel da como resultado una disminución del tamaño de los poros y de la rugosidad de la superficie. Esta disminución en el tamaño de los poros sugiere la presencia de PE en la superficie del hidrogel, lo que promueve su rápida liberación cuando se implanta in vivo. Esta rápida liberación de agentes antibacterianos como el PE es importante para detener la invasión bacteriana.

Imágenes SEM de hidrogeles reforzados con fibra a diferentes aumentos (×200, ×500 y ×1000) e imágenes de sección transversal relacionadas de la misma muestra (×200). (A) CNF/PVA, (B) CNF/PVA/PE1 y (C) CNF/PVA/PE2.

La Figura 5 ilustra los espectros FT-IR de muestras de hidrogel de PVA/CNF cargadas con PE y PE. El espectro IR de la muestra de PE, Fig. 5A, muestra una banda ancha centrada en 3410 cm-1, que normalmente se atribuye a la vibración de estiramiento O-H de los compuestos fenólicos37. Las dos bandas en 2920 y 2840 cm-1 están relacionadas con el estiramiento asimétrico y simétrico de compuestos de hidrocarburos C – H, respectivamente38. Mientras que las bandas en 1720 y 1460 cm-1 se asignan a la vibración de estiramiento del carbonilo C=O del contenido de flavonoides y lípidos. Además, las bandas a 1370 y 1271 cm-1 se deben a vibraciones de tijera de los grupos C – H y vibraciones de estiramiento C – O – H, respectivamente39. Finalmente, las bandas en 1165, 1040 y 870 cm-1 están relacionadas con la vibración de estiramiento del enlace C = C de los alquenos, el enlace C – O – C del éter aromático y la vibración de movimiento C – H de los compuestos fenólicos40.

Espectros FT-IR de (A) PE, (B) CNF/PVA, (C) CNF/PVA/PE1 y (D) CNF/PVA/PE2 hidrogeles reforzados con fibra.

Por otro lado, el espectro FT-IR del hidrogel CNF/PVA muestra una banda ancha a 3294 cm-1, que se debe a la vibración de estiramiento O-H del grupo hidroxilo tanto de PVA como de CNF, como se muestra en la Fig. 5B. . Las bandas en 2905, 1708 y 1420 cm-1 pertenecen a vibraciones de estiramiento C – H, estiramiento C = O y flexión CH2, respectivamente. Las otras bandas a 1040 y 870 cm-1 están relacionadas con las vibraciones de estiramiento de C-O y CH241. Los espectros FT-IR de hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 se muestran en las figuras 5C y D, respectivamente. Los espectros de ambas muestras exhiben picos relacionados con el hidrogel CNF/PVA, con algunas modificaciones. Por ejemplo, las bandas de estiramiento O – H se cambiaron a 3335 y 3351 cm-1 para las muestras CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2, respectivamente. Además, las bandas de estiramiento de C=O se observaron a 1739 cm-1 para la muestra CNF/PVA/PE1 y a 1725 cm-1 para la muestra CNF/PVA/PE2. En conjunto, estos cambios pueden atribuirse a la interacción entre la matriz polimérica CNF/PVA y el propóleo41.

La tendencia a la absorción de agua o el comportamiento de hinchamiento de los hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 se ilustra en la Fig. 6. Las proporciones de absorción de agua para todas las muestras son altas y aumentan gradualmente con el tiempo. . Esto puede referirse a la estructura altamente porosa de las muestras, que permite que el agua se difunda fácilmente a través del hidrogel. Como se muestra en la Fig. 6, las muestras cargadas con PE (CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2) exhiben relaciones de absorción de agua más bajas que las puras (CNF/PVA). Por ejemplo, en un intervalo de tiempo de 12 h, la relación de absorción de agua para CNF/PVA es aproximadamente 907 %, mientras que para CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 son 648 % y 590 %, respectivamente. Por lo tanto, la presencia de PE en los hidrogeles reforzados con fibras CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 disminuye su capacidad de absorción de agua, lo que puede atribuirse a la naturaleza hidrófoba del PE y a la disminución del tamaño de los poros como lo indican las observaciones SEM ( Figura 4)40.

Relación de contenido de agua (%) de las muestras CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 en diferentes intervalos de tiempo.

El propóleo es un material resinoso extraído de los brotes y flores de las plantas y utilizado como agente protector contra la contaminación microbiana42. Los polifenoles son los principales componentes químicos del PE y son responsables de su actividad antimicrobiana43. Se exploró la acción antimicrobiana de los hidrogeles reforzados con fibras de PE y CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 sobre patógenos humanos utilizando diferentes enfoques. La actividad antimicrobiana de la PE se presenta en la Tabla 3 y la Fig. 7. Aunque la PE exhibió potencial antimicrobiano contra todos los microorganismos estudiados, no tiene influencia sobre S. typhimurium como lo informaron Atik et al.44. El hidrogel Control CNF/PVA no tiene ningún efecto contra los microorganismos estudiados. Los resultados muestran una actividad antimicrobiana significativamente mayor contra Gram positivos (S. mutans), sin diferencias significativas entre Gram negativos (E. coli) y C. albicans. Además, la CIM también se determinó mediante la investigación de la actividad antimicrobiana en diferentes concentraciones. La CMI de PE para E. coli fue de 0,012 mg/ml, 0,05 mg/ml para S. mutans y 0,025 mg/ml para C. albicans. Por otro lado, los hidrogeles reforzados con fibra de CNF/PVA con PE a diferentes concentraciones presentan acción antimicrobiana frente a las cepas utilizadas, observándose la mayor actividad antimicrobiana en S. typhimurium, seguido de S. mutans, y otros microbios que no muestran diferencias significativas. . La diferencia en el comportamiento antimicrobiano del PE podría deberse a las diferentes paredes celulares entre las bacterias Gram positivas y negativas45. La actividad del PE como agente antimicrobiano está relacionada con el alto porcentaje de hesperetina (183,7 µg/mL), ácido clorogénico (96,9 µg/mL) y ácido cafeico (90,2 µg/mL) como principales compuestos polifenólicos del PE. Como se ilustra en la Tabla 1, se informó que la hesperetina, el ácido clorogénico y el ácido cafeico son tres compuestos de PE con altas concentraciones. La hesperetina se obtuvo a partir de la hidrólisis enzimática de la hesperidina y se evaluó su actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas y Gram negativas; los resultados revelaron que la hesperetina inhibía más eficazmente los microbios modelo que la hesperidina y el glucósido de hesperidina 46. Yen et al.47. encontraron que el ácido clorogénico era uno de los componentes principales del extracto acuoso de granos de café verde a alta presión y demostró actividad antibacteriana tanto contra Gram positivos (Staphylococcus aureus y Listeria innocua) como Gram negativos (Escherichia coli y Salmonella enterica). El ácido cafeico y su combinación con fitoquímicos antibióticos se evaluaron contra Staphylococcus aureus y los resultados mostraron diversos efectos contra Staphylococcus aureus, variando la CIM de 256 a 1024 µg/mL48. La mayoría de los compuestos de polifenol probados no fueron efectivos contra los microbios modelo utilizados cuando se probaron como un solo compuesto, pero cuando se combinaron con otros compuestos, la actividad de los antimicrobianos aumentó. Según Ahmed et al.49 el ácido gálico a 200 y 400 µg/mL fue eficaz contra S. aureus y S. pyogenes, pero no contra bacterias Gram-negativas. Por otro lado, el antidisolvente extraído del agua residual de almazara combinado con ácido gálico se probó utilizando bajas concentraciones inhibidoras mínimas, lo que reveló que 50/100-100/100 µg/mL causaba una inhibición completa del crecimiento de todas las bacterias utilizadas, debido a la efectos sinérgicos de los compuestos fenólicos contra las bacterias modelo utilizadas. Otro estudio informa que los compuestos polifenólicos extraídos del orujo de uva combinados con representantes de diferentes clases de antibióticos como β-lactámicos, quinolonas, fluoroquinolonas, tetraciclina y anfenicol actúan en sinergia en todas las cepas de S. aureus y E. coli probadas con concentración inhibidora fraccionada. valores del índice (FICI) que varían de 0,031 a 0,155. La CMI se redujo de 4 a 75 veces debido a los efectos sinérgicos de los compuestos fenólicos con diferentes antibióticos50. Estudios anteriores promovieron la membrana compuesta de propóleo para mejorar sus evaluaciones biológicas, por ejemplo, ácido poliláctico/aceite esencial51, poli-ε-caprolactona52, celulosa bacteriana/ZnO-NPs53, quitosano/Ag-NPs54 y poliuretano/nanolignina55. Podemos resumir los principales compuestos polifenólicos bioactivos del PE con actividad antimicrobiana en la Tabla 4.

Actividad antimicrobiana expresada como halozonas del PE a diferentes concentraciones mediante el método de difusión en pozo de agar (A) y en hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 mediante el método de difusión en disco (B) contra cuatro patógenos. microbios.

Las células HFB4 se incubaron con PE durante 24 h a 37 °C en medio para desarrollar una lámina monocapa completa. Se aplicaron diferentes concentraciones de PE hasta concentraciones de 1000 µg/ml. Observamos que la PE en concentraciones superiores a 125 µg/ml reducía significativamente la viabilidad celular según MTT (Fig. 8). Concentraciones de hasta 125 µg/ml no afectaron la viabilidad celular. Además, se utilizó microscopía óptica para confirmar la proliferación celular tras el tratamiento de células HFB4 con diferentes dosis de PE. Se observó claramente una disminución del número de células al aumentar la concentración de PE en comparación con el control (Fig. 8). Estos resultados indican que las concentraciones de PE más allá del límite de 125 µg/ml pueden inducir efectos nocivos en las células HFB4. Estudios anteriores demostraron que la suplementación con extractos naturales puede aumentar la producción de especies reactivas y el estrés oxidativo en pruebas in vitro e in vivo, lo que provoca daño oxidativo y muerte celular73,74.

Viabilidad de células HFB4 tratadas con diferentes concentraciones (31,25–1000 μg/mL) de PE durante 24 h. Los datos se expresaron como el porcentaje medio de formación de formazán en células no tratadas (control). Los datos se obtuvieron de tres experimentos independientes (seis réplicas para cada experimento). (*) significa p menor que 0,05 y **p mayor que 0,05 en comparación con el control.

La Figura 9 muestra la viabilidad de las células HFB4 determinada mediante el ensayo MTT cuando se tratan con diferentes muestras de hidrogeles. La viabilidad de las células tratadas con muestras que contienen PE (CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2) supera la de las muestras de CNF/PVA sin PE. Esto refleja que la presencia de PE mejora la viabilidad de las células HFB4.

(A) Viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, mientras que (B – D) micrografías SEM de células HFB4 después de 24 h sembradas en hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2, respectivamente. (*) significa p menor que 0,05 y **p mayor que 0,05 en comparación con el control.

En la Fig. 9 se muestran imágenes SEM de la propagación y adhesión de células HFB4 tratadas con hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2. Como se ve, todas las células sembradas tienen una forma redondeada, que Puede ser causado por la deshidratación durante el proceso de fijación. La propagación de células en muestras cargadas con propóleo (CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2) es mayor en comparación con una muestra de control sin PE (CNF/PVA). Además, la propagación y unión de las células en la muestra con mayor contenido de PE (CNF/PVA/PE2) es mayor que en la muestra con menor contenido de PE (CNF/PVA/PE1). Por tanto, la presencia de propóleo potencia el crecimiento y la adhesión celular. En general, las pruebas in vitro realizadas en este trabajo ilustran la importancia del hidrogel reforzado con propóleo preparado como material citocompatible que promueve la adhesión celular y la propagación en un entorno 3D.

La estabilización de las membranas de los eritrocitos es un ensayo establecido para investigar el efecto antiinflamatorio de los biomateriales implantados. La inflamación se produce debido a la liberación de diferentes enzimas de las vesículas lisosomales descompuestas75. Por lo tanto, la estabilización de la membrana de los eritrocitos previene la fuga de estas enzimas, así como la incidencia de inflamación75. El ensayo de hemólisis es un ensayo muy crítico, especialmente para materiales que estarán en contacto con la sangre. En la Tabla 5 se explican los resultados de la inhibición de la hemólisis para PE, muestras de hidrogel CNF/PVA y aquellas cargadas con propóleo (CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2). El fármaco indometacina se utilizó como el fármaco difamado (control positivo) y tiene la mayor protección (100 ± 2,362%) a una concentración de 200 µg/ml contra la lisis de glóbulos rojos inducida por hipotonicidad. Como se muestra en la Tabla 2, todas las muestras protegen los eritrocitos humanos de una manera dependiente de la concentración. El efecto protector de la muestra CNF/PVA/PE2 y PE es casi el mismo en diferentes concentraciones. El efecto protector más bajo se registra para la muestra CNF/PVA (sin PE). A partir de estos hallazgos, queda claro que los hidrogeles cargados con PE son prometedores como agentes antiinflamatorios.

El propóleo es un subproducto natural de alto valor para diversas aplicaciones biológicas. Los análisis de HPLC de PE revelaron alrededor de 18 compuestos polifenólicos, siendo la hesperetina la concentración más alta, seguida del ácido clorogénico y el ácido cafeico. El CNF se preparó mediante oxidación-desfibrilación de celulosa obtenida a partir de bagazo de caña de azúcar blanqueado y se utilizó para preparar CNF/PVA sostenible y poroso cargado con diversas concentraciones de PE. Los andamios preparados exhibieron una estructura muy porosa con tamaños de poro de hasta 100 µm. Los hidrogeles de CNF/PVA cargados con PE obtenidos tienen una actividad altamente antimicrobiana contra las bacterias E. coli, S. mutans y luego C. albicans. Las respuestas celulares también mostraron que las células de los hidrogeles CNF/PVA funcionalizados con PE revelaron un microambiente óptimo para la unión y proliferación de células HFB4. Sorprendentemente, nuestros resultados sugirieron que la funcionalización con PE de CNF/PVA no solo mejoró las características antimicrobianas de los hidrogeles de CNF/PVA cargados con PE, sino que también resultó en un potencial antiinflamatorio significativo. Por lo tanto, se recomiendan encarecidamente los experimentos in vivo antes de la aplicación clínica para subrayar la potencia de los hidrogeles CNF/PVA cargados con PE en la cicatrización de heridas.

La pulpa de bagazo blanqueada se obtuvo de Qena Company of Paper Industry, Egipto. TEMPO se compró a Merck. El bromuro de sodio se adquirió de Sigma-Aldrich. El material crudo de propóleo utilizado en este trabajo se recolectó de un apicultor local (Mansoura, Dakahlia, Egipto) en julio de 2022. Se compró alcohol polivinílico PVA (MW 85 000–124 000 g/mol, 99,1 % hidrolizado) de Sigma-Aldrich. En esta investigación también se utilizaron hidróxido de sodio, agua destilada y etanol.

La EP se recopiló según Bozkuş et al.31 con pequeñas modificaciones. En resumen, se disolvieron aproximadamente 10 g de materia prima en 100 ml de etanol al 70% y luego se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 14 días en un lugar oscuro. Después de la filtración usando papel de filtro Whatman (No. 1), la mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante 15 min y luego se secó en estufa a 40 °C durante 5 días hasta peso constante. El PE obtenido se almacenó en refrigeración hasta su uso.

Los compuestos polifenólicos (fenólicos y flavonoides) del PE se analizaron mediante HPLC (serie Agilent 1260, EE. UU.), según Kong et al., con ligeras modificaciones76. Condiciones cromatográficas: la separación cromatográfica se realizó en una columna Eclips C18 (4,6 x 250 mm, 5,0 µm). La fase móvil comprendía (A) agua y (B) ácido trifluoroacético al 0,05% en acetonitrilo a un caudal de 1 ml/min. El gradiente de disolvente fue: 0 min 82 % A, 0 a 5 min 80 % A, 5 a 8 min 60 % A, 8 a 12 min 60 % A, 12 a 15 min 82 % A, 15 a 16 min 82 % A y 16–20 min 82% A. El detector de longitudes de onda múltiples se controló a 280 nm. El volumen de inyección fue de 5 µl para cada una de las soluciones de muestra. La temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C.

Se utilizó bagazo blanqueado para la preparación de CNF oxidado con TEMPO utilizando el método descrito por Salama et al.35. En resumen, se dispersaron 20 g de pulpa de bagazo blanqueada en agua destilada con TEMPO (0,8 g) y bromuro de sodio (8 g). Después de esto, se añadieron continuamente 300 ml de solución de hipoclorito de sodio (15%) y el pH se ajustó a 10 usando una solución de NaOH (3 mol/l). Al final de la reacción, se redujo el pH a 7,0 y el producto se centrifugó varias veces a 10.000 rpm. Se realizó diálisis usando agua desionizada para purificar el producto.

El hidrogel poroso de CNF/PVA se preparó utilizando los métodos de liofilización y liofilización según Müller et al.77. La relación en peso polimérica se ajustó a 50:50 (CNF:PVA). En resumen, se prepararon 30 ml de solución de PVA con una concentración del 10% en peso en agua destilada mediante agitación magnética a 95 °C. Después de 4 h, se agregaron 100 ml de solución de CNF (3% en peso) a la solución de PVA y se sometió a agitación mecánica durante 10 minutos a 5000 rpm. Luego, la mezcla de CNF/PVA se vertió en un molde redondo de 10 cm y se congeló a -40 °C durante 3 h, seguido de descongelación a temperatura ambiente durante 3 h para permitir la reticulación del PVA. Los hidrogeles obtenidos se sometieron a cuatro ciclos de congelación-descongelación y posteriormente se liofilizaron a -80 °C. Para producir hidrogeles de CNF/PVA cargados con PE, se disolvieron diferentes proporciones de PE (0,1 y 0,2 g) en 2 ml de etanol y luego se añadieron a 22 ml de la mezcla de solución de suspensión de CNF/PVA. Las mezclas se mantuvieron en un agitador magnético a 40 °C durante 1 h para asegurar la disolución completa del PE. Las soluciones se homogeneizaron mediante agitación mecánica durante 10 minutos a 5000 rpm antes de verterlas en un molde redondo y someterlas a un ciclo de congelación-descongelación y finalmente liofilizarse a -80 °C, como se mencionó anteriormente. Las muestras preparadas se denominaron CNF/PVA para control (sin PE), CNF/PVA/PE1 para muestra con 0,1 g de PE y CNF/PVA/PE2 para muestra con 0,2 g de PE.

La morfología del hidrogel CNF/PVA preparado reforzado con diferentes concentraciones de PE se examinó mediante microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FE-SEM) (JSM 6360LV, JEOL/Noran). La estimación del tamaño de los poros se determinó a partir de diferentes imágenes SEM utilizando la herramienta de ángulo de ImageJ con el software Java 1.8.0 (National Institute of Health (NIH), EE. UU.)78. Se utilizó el FT-IR (modelo FT/IR-6100 tipo A) para investigar los grupos funcionales químicos de las muestras. Los espectros se registraron con números de onda en el rango de 400 a 4000 cm-1. El patrón XRD se registró con un difractómetro de polvo empíreo (Cu Kα, 0,154 nm) entre 5 y 70° 2θ con un tamaño de paso de 0,01°/s para examinar la fase formada en el CNF preparado. Se aplicó un microscopio electrónico de transmisión de ultra alta resolución (JEOL-2010) para examinar la estructura interna de CNF.

La evaluación del hidrogel preparado para la absorción de agua se llevó a cabo según Eskandarinia et al.79 con ligeros cambios. Se cortaron hidrogeles reforzados con fibra preparados (CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2) en 1 cm x 1 cm, se pesaron con precisión (Wi) y se sumergieron en 10 ml de agua destilada en viales sellados a 37ºC. °C. A intervalos de tiempo programados (1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 12 h), se retiraron muestras de los viales, se secaron con un pañuelo de papel para eliminar el agua de la superficie y se pesaron (Ww). La relación de absorción de agua (hinchamiento) de las muestras se especifica según la siguiente ecuación:

La actividad antimicrobiana de los hidrogeles reforzados con fibras de PE, CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 se evaluó frente a cuatro patógenos seleccionados, incluidas bacterias gramnegativas [Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli) y Salmonella typhimurium. ATCC 14028 (S. typhimurium)], bacterias Gram positivas [Streptococcus mutans ATCC 25175 (S. mutans)] y levadura [Candida albicans ATCC 10231 (C. albicans)]. Todos los microbios fueron proporcionados por la American Type Culture Collection (ATCC). Las cepas microbianas se cultivaron en un tubo de ensayo que contenía 5 mL de caldo Mueller Hinton compuesto por (%): 0,2 extracto de carne, 1,75 hidrolizado ácido de caseína y 0,15 almidón, en cultivo continuo (200 rpm) durante 1 día a 37 °C. . La actividad antimicrobiana del propóleo y de diferentes muestras de hidrogel se llevó a cabo mediante el método de difusión en pozos de agar y en disco, respectivamente.

La acción antimicrobiana del PE fue evaluada cualitativamente mediante la técnica de difusión en pozo de agar según Roy y Rhim80, con pocas modificaciones. En breve, la suspensión microbiana (108 UFC/ml) con una concentración o densidad aproximadamente igual a los estándares de McFarland 0,5 se extendió sobre la superficie de la placa de Petri que contenía medio agar Mueller Hinton (2%). La concentración mínima inhibidora (CIM) es la concentración mínima de PE que muestra una zona de inhibición baja frente al objetivo microbiano. Para la determinación de la CIM, se extrajo propóleo a diferentes concentraciones de 0,1, 0,05, 0,025, 0,012 y 0,006 mg/ml (etiquetados como 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente) en los pocillos del medio (4 mm de diámetro). por un barrenador vítreo estéril y cargado con 65 μL de propóleo probado. El control negativo se realizó cargando los pocillos centrales con DMSO.

La actividad antimicrobiana de los hidrogeles reforzados con fibras CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 preparados se llevó a cabo mediante el método de difusión en disco según Yahia et al.81, con modificaciones menores. En resumen, se distribuyeron por separado 100 µl de patógenos diluidos en serie en placas de Petri de medio de agar Mueller Hinton junto con discos (5 mm de diámetro) de membranas compuestas cargadas con diferentes concentraciones de propóleo. Como control se utilizó el hidrogel reforzado con fibra sin propóleo.

Todas las placas se dejaron a 4 °C durante 120 min. para completar la difusión de la muestra analizada e inhibir los microbios modelo, posteriormente se incubó a 37 °C durante 1 día, donde se evaluó la actividad antibacteriana midiendo el diámetro de la zona de inhibición desarrollada (incluido el pocillo o el disco de membrana) después de la período de incubación. Para garantizar las condiciones asépticas, todas las membranas se esterilizaron durante 30 minutos bajo luz ultravioleta antes de su aplicación. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se representaron los resultados medios.

El ensayo de citotoxicidad de hidrogeles reforzados con fibras CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 y también PE contra células HFB4 se realizó utilizando el MTT (3-4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5 -ensayo de bromuro de difenil-2H-tetrazolio)82,83. Los hidrogeles preparados se enjuagaron con medio tres veces y luego se sembraron en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. La placa de 24 pocillos se inoculó con 1 x 105 células/ml (1000 µl/pocillo) y se incubó a 37 °C durante 24 h para desarrollar una lámina monocapa completa. Se observaron las células para determinar la formación de láminas y los efectos de citotoxicidad. Se comprobaron las células HFB4 para detectar cualquier signo físico de toxicidad, por ejemplo, pérdida total o parcial de la monocapa, redondeo, contracción o granulación celular. Se preparó una solución de MTT (5 mg/ml en PBS) (BioBasic Canada Inc). Se añadieron 100 µl de solución de MTT a cada pocillo. Colóquelo en una mesa agitadora, 150 rpm durante 5 minutos, para mezclar bien el MTT con el medio. Incubar (37 °C, 5% CO2) durante 4 h para permitir que se metabolice el MTT. Después de eso, se mezclaron 200 μL de DMSO con las células del cultivo para solubilizar los cristales de formazán, que se obtuvieron mediante la reducción de MTT en células vivas. Posteriormente, se calculó la absorbancia media de cada pocillo a 570 nm utilizando un espectrofotómetro. Se realizaron tres experimentos paralelos. La absorbancia debe estar directamente correlacionada con la cantidad de células82,83. Para PE, la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos se inoculó con 1 x 105 células/ml (100 µl/pocillo) y se incubó a 37 °C durante 24 h para desarrollar una lámina monocapa completa. Se decantó el medio de crecimiento de placas de microtitulación de 24 pocillos después de que se formara una lámina confluente de células. Luego la monocapa celular se lavó dos veces con medios de lavado. Se realizó una dilución doble de la muestra analizada en medio RPMI con suero al 2% (medio de mantenimiento). Se probó 0,1 mL de cada dilución en diferentes pocillos, dejando 3 pocillos como controles, recibiendo solo medio de mantenimiento. Luego se realizaron los mismos pasos mencionados anteriormente.

Las células HFB4 se cultivaron en placas de 24 pocillos que contenían hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE284. Después de 24 h de incubación, las células se fijaron con glutaraldehído al 5% (V/V) y luego se deshidrataron gradualmente con soluciones seriadas de etanol (70-100% durante 20 minutos cada una). Después de eso, las muestras se rociaron con oro para realizar observaciones SEM.

La preparación de la suspensión de eritrocitos se realizó según Anosike et al.75. En resumen, se colocaron aproximadamente 3 ml de sangre entera fresca extraída de voluntarios sanos en tubos heparinizados y luego se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos. Se utilizó un volumen de solución salina normal igual al del sobrenadante para disolver los gránulos de sangre roja. El volumen de los gránulos de glóbulos rojos disueltos obtenidos se midió y se devolvió como una suspensión al 40 % v/v con una solución tampón isotónica (tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7,4). La solución tampón se formó a partir de 0,2 g de NaH2PO4, 1,15 g de Na2HPO4 y 9 g de NaCl en 1 L de agua destilada. Los glóbulos rojos devueltos (sobrenadante resuspendido) se utilizaron como tales.

Se trituraron cuidadosamente pesos iguales de hidrogeles reforzados con fibra CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 y CNF/PVA/PE2 y se suspendieron en agua destilada (solución hipotónica). Se colocaron 5 ml de la solución hipotónica de dosis graduadas de las muestras (100, 200, 400, 600, 800 y 1000 µg/ml) en pares duplicados (por dosis) de los tubos de centrífuga. También se colocaron 5 ml de solución isotónica de dosis graduadas de las muestras (100–1000 µg/ml) en pares duplicados (por dosis) de los tubos de centrífuga. Se realizaron los mismos pasos anteriores para la resina PE, pero sin triturar. Como tubos de control se utilizaron un tubo que contenía 5 ml del vehículo (agua destilada) y otro tubo que contenía 5 ml de 200 µg/ml de indometacina, respectivamente. Se añadió una suspensión (0,1 ml) de eritrocitos a cada uno de los tubos y se mezcló suavemente. Las mezclas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente (37 °C) y luego se centrifugaron durante 3 min a 1300 rpm. La absorbancia (Ab) de la hemoglobina dentro del sobrenadante se estimó en 540 nm usando un espectrofotómetro Spectronic (Milton Roy). Para calcular el porcentaje de hemólisis, se supuso que la hemólisis formada en presencia de agua destilada era del 100%. El porcentaje de inhibición de la hemólisis por el extracto se calculó así:

donde Ab1 = absorbancia de la muestra de prueba en solución isotónica, Ab2 = absorbancia de la muestra de prueba en solución hipotónica, Ab3 = absorbancia de la muestra de control en solución hipotónica75,85.

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron con la prueba ANOVA unidireccional, utilizando el software Sigma Stat 3.5 (Dundas Software Ltd, Toronto, Canadá). Los valores de p ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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SS, AMA: metodología, investigación, análisis formal, redacción del borrador original. A.Salama, A.Saleh, ET: conceptualización, metodología, investigación, análisis formal, redacción: revisión y edición. BAE: investigación, análisis formal, redacción: revisión y edición.

Correspondencia a Ahmed K. Saleh.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Saleh, S., Salama, A., Ali, AM et al. Extracto de propóleo egipcio para la funcionalización de hidrogel poroso de nanofibras de celulosa/alcohol polivinílico junto con caracterización y aplicaciones biológicas. Representante científico 13, 7739 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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Recibido: 07 de diciembre de 2022

Aceptado: 09 de mayo de 2023

Publicado: 12 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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