Desarrollo de recubrimientos de nanofibras de quitina para prolongar la vida útil e inhibir el crecimiento bacteriano en pepinos frescos

Aug 08, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13195 (2023) Citar este artículo

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El uso generalizado de polímeros derivados del petróleo como envases de un solo uso ha tenido efectos nocivos para el medio ambiente. En este sentido, desarrollamos recubrimientos sostenibles de nanofibras de quitina (ChNF) que prolongan la vida útil de los pepinos frescos y retrasan el crecimiento de bacterias patógenas en sus superficies. Los ChNF con diversos grados de acetilación se prepararon con éxito mediante desacetilación utilizando NaOH con tiempos de tratamiento de 0 a 480 minutos y se desfibrilaron mediante mezcla mecánica. Con tiempos de reacción de desacetilación más largos, más grupos acetamido (–NHCOCH3) en las moléculas de quitina se convirtieron en grupos amino (–NH2), lo que impartió propiedades antibacterianas a los ChNF. Las morfologías de ChNF se vieron afectadas por el tiempo de reacción de desacetilación. Los ChNF desacetilados durante 240 min tenían un ancho promedio de 9,0 nm y longitudes de hasta varios μm, mientras que los ChNF estructurados en forma de varilla con un ancho medio de 7,3 nm y una longitud promedio de 222,3 nm se obtuvieron con un tiempo de reacción de 480 min. Además, demostramos un recubrimiento ChNF independiente para extender la vida útil de los pepinos. En comparación con los ChNF estructurados en forma de varilla, los ChNF desacetilados de 120 y 240 minutos exhibieron una estructura similar a fibrillas, que retrasó considerablemente la pérdida de humedad de los pepinos y la tasa de crecimiento de bacterias en sus superficies externas durante el almacenamiento. Los pepinos recubiertos con estos ChNF desacetilados de 120 y 240 minutos demostraron una tasa de pérdida de peso menor de ⁓ 3,9% día-1 en comparación con los pepinos sin recubrimiento, que exhibieron una tasa de pérdida de peso de 4,6% día-1. Este efecto protector proporcionado por estos ChNF renovables tiene un potencial prometedor para reducir el desperdicio de alimentos y el uso de materiales de embalaje a base de petróleo.

Los envases de alimentos, que generalmente están hechos de polímeros a base de petróleo, como el polietileno (PE), el polipropileno (PP) y el poli(tereftalato de etileno) (PET), desempeñan un papel importante en la protección de los alimentos contra agentes externos físicos, microbiológicos y químicos. daño1,2,3. En consecuencia, se preserva la calidad y frescura de los alimentos y se reduce el desperdicio de alimentos4,5. Debido a estos beneficios, que se han vuelto más esenciales a la luz de la pandemia de COVID-19, se estima que la industria mundial del envasado de alimentos tendrá un valor de 464 mil millones de dólares en 20276,7. El alto consumo de envases de origen fósil y su lenta cinética de degradación han afectado negativamente al medio ambiente y la vida silvestre en forma de desechos de vertederos, emisiones de gases de efecto invernadero y microplásticos4,8,9,10. Por lo tanto, el desarrollo de materiales de embalaje biodegradables y respetuosos con el medio ambiente ha atraído considerable atención como una alternativa práctica6,9,11,12,13. Los biopolímeros, como los polisacáridos, lípidos y proteínas, son materiales prometedores en los sectores del embalaje debido a su biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad3,7,9.

La quitina (poli(β-(1-4)-N-acetil-d-glucosamina)) es el segundo biopolímero más abundante en la Tierra después de la celulosa14,15,16 y es de considerable interés debido a su estabilidad química, biocompatibilidad, biodegradabilidad, no toxicidad y propiedades mecánicas17,18. La quitina es un polímero semicristalino con una arquitectura microfibrilar incrustada en una matriz proteica que se encuentra en los exoesqueletos de artrópodos, incluidos camarones, cangrejos y langostas10,14,15,19. Cada microfibrilla de quitina comprende nanofibras con un ancho de 2 a 5 nm y longitudes de hasta varios μm20,21,22. Las nanofibras de quitina (ChNF) exhiben un rendimiento superior con un módulo de Young de ⁓ 40 GPa, una resistencia de 1,6 GPa y una densidad de 1 a 1,3 kg m-3. Además, se ha informado que las películas de ChNF tienen propiedades de barrera mucho mejores (O2 y CO2) que las películas comerciales de PP, PE y PET debido a la estructura altamente cristalina de los ChNF23,24,25. Debido a estas excelentes propiedades asociadas con la biodegradabilidad y la sostenibilidad, los ChNF se han utilizado ampliamente en diversas aplicaciones, como nanocompuestos, membranas, fármacos, recubrimientos y alimentos funcionales2,20,22,26.

Los caparazones de cangrejo y camarón generalmente se tratan como desperdicios de alimentos en la industria pesquera10,27. Tailandia tiene una gran cantidad de desechos de cáscaras de camarón que potencialmente se utilizan como materia prima para preparar ChNF28. Para desintegrar los ChNF individualizados, es necesaria la alta fuerza mecánica generada por una máquina poderosa (es decir, homogeneización y molienda a alta presión) para destruir los fuertes enlaces de hidrógeno entre las nanofibras22,29. Sin embargo, este procesamiento mecánico consume mucha energía, lo que genera un coste elevado29,30. Ifuku et al.19 descubrieron que, aunque los ChNF se prepararon con éxito a partir de caparazones de cangrejo utilizando un molinillo industrial, la distribución del ancho de los ChNF estaba en un amplio rango de 10 a 100 nm. De manera similar, no se pudo lograr una individualización exitosa de los ChNF utilizando únicamente ultrasonido31. Por lo tanto, se ha realizado una modificación química de la superficie de quitina para producir ChNF27 individualizados. Los grupos hidroxilo primarios en la posición C6 en las moléculas de quitina se convirtieron selectivamente en grupos carboxilato mediante oxidación mediada por el radical 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO). Se descubrió que el contenido de carboxilato de quitina domina la repulsión eléctrica entre nanofibras con cargas aniónicas, lo que da como resultado la individualización de los ChNF mediante tratamiento mecánico27. Se obtuvieron ChNF más individualizados a partir de quitina con mayor contenido de carboxilato27. Sin embargo, el alto gasto químico de TEMPO limita el uso generalizado de esta ruta química. También se ha informado que la desacetilación por NaOH para reemplazar los grupos acetamido por grupos amino en las moléculas de quitina debilita la interacción del hidrógeno entre las cadenas moleculares de quitina, lo que ayuda a la individualización de los ChNF30,32. Machida et al.32 informaron que se podían obtener ChNF con anchos más pequeños con una mayor conversión de grupos acetamido en grupos amino mediante desacetilación por NaOH. También se sugirió que estos grupos amino son importantes para las propiedades antimicrobianas a través de la interacción entre grupos amino protonados y residuos negativos en las membranas celulares bacterianas33,34. Por lo tanto, adaptar el número de grupos amino en la superficie de ChNF mediante desacetilación con NaOH sería un método eficaz para obtener nanofibras individualizadas asociadas con propiedades antimicrobianas.

Aunque los ChNF se han preparado a partir de exoesqueletos de crustáceos y paredes celulares de hongos mediante diversos tratamientos químicos3,32,35,36, los efectos del tiempo de reacción de desacetilación sobre las propiedades de los ChNF no se han estudiado exhaustivamente y la eficiencia de los ChNF como Aún se desconoce el recubrimiento para aplicaciones de envases en contacto con alimentos. En este documento, informamos las propiedades de los ChNF preparados a partir de desechos de cáscara de camarón con varios tiempos de reacción de desacetilación. Se evaluó el efecto del tiempo de reacción de desacetilación sobre las características de los ChNF, incluida la estructura química, el grado de acetilación (DA), la cristalinidad, las propiedades térmicas, el potencial zeta (ζ), la morfología y las propiedades antimicrobianas. Luego, las suspensiones de ChNF se aplicaron como recubrimientos independientes para extender la vida útil de los pepinos frescos, y se investigaron por primera vez la pérdida de humedad y las actividades microbianas de los pepinos recubiertos con ChNF. Dado su prometedor rendimiento, el recubrimiento ChNF sostenible y biodegradable muestra un gran potencial para aplicaciones poscosecha y de envasado de alimentos, lo que constituye un enfoque eficaz para reducir el desperdicio de alimentos y el consumo de envases de plástico de un solo uso.

Se adquirieron cáscaras de camarón secas (Litopenaeus vannamei) de Marine Bio Resource Co., Ltd. (Tailandia). El HCl concentrado (6 N) y el etanol (99,5%) fueron suministrados por Fujifilm Wako Pure Chemical Industries (Japón). Los gránulos de NaOH (97%) fueron proporcionados por Nacalai Tesque Inc. (Japón). Los pepinos frescos (Cucumis sativus) utilizados en este estudio se compraron en un supermercado local en Bangkok, Tailandia. Para los experimentos se seleccionaron cuidadosamente pepinos con formas y colores consistentes y sin ningún signo de infección o daño por hongos. Los experimentos con pepinos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y la legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes.

Para extraer ChNF de los exoesqueletos de camarón, se aplicaron una serie de pasos de tratamiento químico20,27,37,38. Inicialmente, las cáscaras de camarón se trituraron hasta convertirlas en polvo con una licuadora. Los polvos de cáscara de camarón (80 g) se desmineralizaron en 1200 ml de HCl 2 M, se agitaron vigorosamente durante 4 h a temperatura ambiente y se lavaron con agua destilada hasta neutralidad. Posteriormente los polvos tratados se remojaron en 1000 mL de etanol con agitación continua durante 48 h a temperatura ambiente para eliminar los pigmentos y luego se lavaron con agua destilada varias veces. Finalmente, los polvos de quitina resultantes se desacetilaron con NaOH al 30 % a 90 °C durante tiempos de tratamiento específicos de 120, 240 y 480 min, se neutralizaron y se secaron adicionalmente a 60 °C durante 24 h. Posteriormente, los polvos de quitina desacetilada se diluyeron con agua destilada y se introdujeron unas gotas de ácido acético en la suspensión de quitina al 0,75% en peso para obtener un pH de ⁓ 3. La quitina se desfibriló usando una mezcla de alta velocidad (licuadora Stormmix 3500W, Tailandia). ) a 42.000 rpm durante 7,5 min. Esta desintegración mecánica se repitió cuatro veces en intervalos de 15 minutos para evitar el sobrecalentamiento. Las suspensiones de ChNF se mantuvieron a ⁓ 4 °C antes de su uso. Las muestras de ChNF desacetiladas durante 0, 120, 240 y 480 minutos se denominaron C0, C120, C240 ​​y C480, respectivamente.

Los espectros FTIR de las muestras de ChNF se registraron utilizando un espectrómetro FTIR Nicolet iS5 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) con un modo de reflectancia total atenuado. Los materiales de ChNF se analizaron en la región del número de onda de 600 a 4000 cm-1 con una resolución de 4 cm-1 con 32 exploraciones repetidas.

Los análisis estructurales de las muestras de ChNF desacetilado se realizaron mediante espectroscopia de RMN 13C de estado sólido (Bruker Avance III HD/Ascend 400 WB, EE. UU.). Los espectros de RMN se registraron a temperatura ambiente utilizando una frecuencia de 13C de 100,6 MHz y una acumulación de 4096 exploraciones. Los DA de los materiales ChNF se determinaron a partir de la integral (I) del grupo metilo (CH3) y los átomos de C (C1–6) de la estructura principal de quitina utilizando la siguiente ecuación39,40:

La XRD de las muestras de ChNF desacetilada se realizó utilizando un difractómetro de rayos X (D8 DISCOVERY, Bruker AXS, Alemania). Las muestras de ChNF se escanearon en el rango 2θ de 5 a 50 ° utilizando radiación Cu Kα (longitud de onda de 1,54 Å) generada con un voltaje de aceleración de 40 kV, corriente de 40 mA, aumento de paso de 0,02 ° y velocidad de paso de 0,8 s. . Los grados de cristalinidad de las muestras de ChNF se calcularon en función del tiempo de tratamiento de desacetilación a partir de la intensidad del pico de difracción ubicado en 19,6° (I110), correspondiente a la región cristalina, y el área amorfa obtenida de la intensidad basal ubicada en 16,0. ° (IAM) utilizando la siguiente ecuación27,41:

Las estabilidades térmicas de las muestras de ChNF se determinaron utilizando un analizador Pyris 1 TG (PerkinElmer, EE. UU.). Una muestra de ChNF con un peso de ⁓ 10 mg se mantuvo a 110 °C durante 20 minutos para eliminar la humedad y luego se calentó a 800 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1 bajo un caudal de N2 de 50 ml min-1. 1.

Las cargas superficiales (potencial ζ) de las suspensiones de ChNF (0,1% en peso) se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (Zetasizer, Nano ZSP, Malvern Panalytical Ltd., Reino Unido) a 25 °C.

Las morfologías de los ChNF desacetilados se monitorearon utilizando TEM (JEM-1400, JEOL, Japón) operando a un voltaje de aceleración de 80 kV. Se depositó una gota de suspensión de ChNF al 0,01% en peso sobre una rejilla de cobre y se tiñó con acetato de uranilo al 1% durante 3 minutos. Los anchos y longitudes promedio de los ChNF desacetilados se determinaron midiendo 100 nanofibras individuales utilizando el software ImageJ.

Inicialmente, los pepinos frescos se lavaron con agua del grifo para eliminar la suciedad y se secaron con una toalla de papel. Luego se recubrieron cinco pepinos con cada suspensión de ChNF al 0,75% en peso (C0, C120, C240 ​​y C480) mediante inmersión en la suspensión durante 2 minutos. Los pepinos recubiertos se secaron al aire a temperatura ambiente durante 5 min. El proceso de recubrimiento se repitió cuatro veces más para cada pepino para obtener un recubrimiento uniforme y completo. Como muestra de control se utilizaron pepinos recubiertos con agua destilada utilizando el mismo procedimiento. Luego, los pepinos recubiertos se almacenaron a una temperatura de 30 ± 3 °C durante 5 días para evaluar el impacto de los recubrimientos de ChNF en la extensión de su vida útil. Se controló diariamente el peso y el aspecto de los pepinos.

Las actividades antimicrobianas in vitro de las muestras de ChNF contra Escherichia coli (E. coli ATCC 25922) y Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium ATCC 13311) se determinaron utilizando el método de mancha en el césped42 (Fig. 1a). El experimento se realizó en condiciones asépticas. Cada bacteria se inoculó por separado en caldo tríptico de soja (TSB) y se incubó a 37 °C durante 24 h. Luego se mezcló una muestra de 50 µl de cada cultivo con 5 ml de agar blando TSB fundido (TSB + agar al 1%) y se vertió en una placa de agar TSB. Una vez que se colocó la placa de agar, se colocaron 10 µl de la suspensión de ChNF (0,75% en peso) en la superficie del agar (es decir, césped indicador). El control se preparó reemplazando la suspensión de ChNF con ácido acético al 1%. Luego la placa se secó en condiciones estériles y se incubó a 37 °C durante 24 h. Una zona clara alrededor de la mancha indicaba inhibición bacteriana.

Diagrama esquemático de la prueba de provocación bacteriana. (a) Ensayo de actividad antimicrobiana mediante el método de la mancha en el césped; (b) preparación de pepino y desafío bacteriano; (c) disposición de los tratamientos de pepino.

En el segundo experimento, se determinaron las actividades antibacterianas de las suspensiones de ChNF contra E. coli y S. Typhimurium en las superficies exteriores del pepino durante el almacenamiento (Fig. 1b). Todos los pasos se llevaron a cabo en condiciones asépticas. Los pepinos frescos se cortaron verticalmente por la mitad y se dispusieron en bandejas de aluminio esterilizadas. Las superficies exteriores del pepino se esterilizaron con luz ultravioleta (UV) durante 15 minutos en una cabina de bioseguridad. Se inoculó un área de 2 × 2 cm2 de la superficie exterior del pepino esterilizado con 10 µL de suspensión de E. coli o S. Typhimurium (7 log UFC mL-1 en solución esterilizada de NaCl al 0,85%) y se secó al aire en una cabina de bioseguridad durante 10 mín. Luego se aplicó una alícuota de 10 µl de la suspensión de ChNF (0,75% en peso) al área inoculada y se secó a temperatura ambiente en condiciones estériles (Fig. 1c). Para el control, la suspensión de ChNF se reemplazó con un volumen igual de ácido acético al 1%. Luego las bandejas se cubrieron con una bolsa de plástico PE y se almacenaron a 4 °C. La viabilidad de E. coli y S. Typhimurium en las superficies exteriores del pepino se controló a los 0, 1, 3 y 7 días de almacenamiento mediante una prueba con hisopo. Brevemente, se frotó un hisopo de algodón estéril contra la superficie exterior del pepino inoculado y se colocó en 10 ml de solución salina normal estéril (NaCl al 0,85%). Posteriormente se realizó una dilución en serie. E. coli y S. Typhimurium (expresados ​​como log UFC cm-2) se contaron en agar Chromocult Coliform (Merck, Alemania) y agar xilosa lisina desoxicolato (BD, EE. UU.), respectivamente. Los experimentos se realizaron por triplicado.

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete R (R.4.1.1). La significación estadística se fijó en α = 0,05. Posteriormente se examinaron las diferencias de medias mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan. Para la prueba de provocación bacteriana en los pepinos, los datos y los datos transformados logarítmicamente no siguieron una distribución normal. Por lo tanto, los datos de la prueba de exposición bacteriana se analizaron utilizando un método no paramétrico de Kruskal-Wallis seguido de la comparación no paramétrica de todos los pares de Dunn.

La desacetilación exitosa de ChNF usando NaOH con varios tiempos de tratamiento se evaluó mediante FTIR (Fig. 2a). El pico correspondiente al estiramiento de OH intra e intermolecular se produjo a 3450 cm-1, y el estiramiento de NH y las vibraciones de la amida secundaria de NH se observaron desde los picos ubicados a 3257 y 3100 cm-1, respectivamente8,10,43,44. Además, se encontraron dobletes atribuidos a la amida I (estiramiento C=O) en 1655 y 1620 cm-1, y la banda de amida II (flexión N-H) en 1555 cm-1 y la banda de amida III (estiramiento C-N) en Se observaron 1310 cm−119,43,44,45. En particular, la banda de absorción relacionada con la existencia de proteína (⁓ 1420 cm-1) no se observó en todos los materiales de ChNF, lo que sugiere que los múltiples pasos de tratamiento químico utilizados en este documento podrían eliminar proteínas y purificar partículas de quitina10,19,44. Las muestras de ChNF desacetilado (C120, C240 ​​y C480) presentaron una banda de absorción menos intensa a 1655 cm-1 (relacionada con la estructura de la amida) que la muestra de ChNF no desacetilado (C0). Con el aumento del tiempo de tratamiento de desacetilación, la intensidad de esta banda de amida disminuyó gradualmente, lo que se atribuyó a la conversión de grupos acetamido en las moléculas de quitina en grupos amino. En particular, la banda amino en ⁓ 1588 cm-1 no se observó para los ChNF debido al fuerte dominio de las bandas amida I y II sobre las bandas amino10,46. Sin embargo, con valores de DA más bajos, la banda amino se desplazó hacia un número de onda más alto debido a la reducción de la superposición de las bandas amida46.

(a) Espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) y (b) resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C de nanofibras de quitina (ChNF) con diferentes tiempos de tratamiento de desacetilación. (c) patrones de difracción de rayos X (DRX), (d) cristalinidad y tamaños de cristales, y (e) curvas termogravimétricas (TG) y (f) termogravimétricas derivadas (DTG) de ChNF en función del tiempo de tratamiento de desacetilación.

La Tabla 1 presenta los DA de los ChNF en función del tiempo de tratamiento de desacetilación. Los principales picos de resonancia de las nanopartículas de quitina se ubicaron en 173,4 (C=O), 103,9 (C1), 82,9 (C4), 75,5 (C5), 73,2 (C3), 60,7 (C6), 54,9 (C2) y 22,6. ppm (CH3) (Figura 2b). La DA del C0 fue del 95,3%. Después del tratamiento con NaOH al 30 % durante 120 min, la DA del C120 se redujo considerablemente al 76,2 %, es decir, ⁓ 25 % de los grupos acetamido se convirtieron en grupos amino. Se encontró una conversión gradual de grupos acetamido a grupos amino al aumentar el tiempo de tratamiento. Se observaron reducciones en DA al 73,0 % y 69,2 % para C240 ​​y C480, respectivamente. La mayor conversión durante el tiempo de desacetilación inicial se atribuyó al proceso de desacetilación, que interactuó principalmente con la superficie de quitina antes de penetrar el interior de los haces de fibrillas de quitina32.

La Figura 2c muestra los perfiles XRD y los índices cristalinos de los ChNF desacetilados. Todas las muestras de ChNF tuvieron cinco picos de difracción típicos a 9,3°, 19,4°, 21,2°, 23,4° y 26,5°, atribuidos a los planos de red [020], [110], [120], [130] y [013]. , respectivamente19,47. Estos picos de difracción característicos coincidían con los de la estructura de la α-quitina20,27,29. La cristalinidad del C0 fue del 94,1%. En particular, el índice de cristalinidad de la quitina depende de las materias primas y de los pasos del tratamiento químico utilizados en su purificación48,49. Además, se evaluó el efecto del tiempo de tratamiento de desacetilación sobre el grado de cristalinidad de la quitina. El tiempo de desacetilación no tuvo una influencia considerable en la cristalinidad de los materiales de ChNF (Fig. 2d; Tabla 1), lo que podría deberse a que la desacetilación solo ocurrió en la superficie del cristalito de quitina cuando se usó una concentración baja de NaOH20,27.

Además, en la figura 2d se presentan los tamaños de cristal de los planos [020] y [110] de las muestras de ChNF en función del tiempo de desacetilación, calculado a partir de los perfiles XRD. El C0 tenía tamaños de cristal en los planos [020] y [110] de 7,8 y 5,5 nm, respectivamente. Ambos tamaños de cristales en los planos [020] y [110] disminuyeron al aumentar el tiempo de tratamiento de desacetilación. Los tamaños de cristal en los planos [020] y [110] de C240 ​​fueron 7,2 y 5,3 nm, respectivamente, mientras que los tamaños de cristal en los planos [020] y [110] de C480 fueron 7,1 y 5,3 nm, respectivamente. Esto indicó que la reacción de desacetilación con un tiempo de procesamiento más prolongado podría producir ChNF con anchos más pequeños en el rango de 5 a 7 nm.

Se investigaron las estabilidades térmicas de los ChNF desacetilados con respecto al tiempo de tratamiento. Las curvas TG y termogravimétrica derivada (DTG) de los ChNF desacetilados en función del tiempo de tratamiento se presentan en las figuras 2e y f. Normalmente, el estado de transición térmica inicial se produce a <100 °C debido a la evaporación del agua unida a la quitina por los grupos hidroxilo y amino33,50. Sin embargo, esta etapa de transición no se encontró en las curvas TG de las muestras de ChNF ya que todas las muestras de ChNF se mantuvieron a 110 °C durante 20 minutos para eliminar completamente el agua adsorbida o unida por enlaces de hidrógeno con las moléculas de quitina50,51. La mayor parte de la degradación térmica de la quitina ocurre entre 200 y 400 °C, atribuida a la despolimerización de la cadena de quitina asociada con la descomposición térmica de los anillos de piranosa mediante la escisión de los enlaces glicosídicos entre los anillos de N-glucosamina y N-acetilglucosamina50,51. C0 presentó un único pico de DTG con una temperatura máxima de degradación (Tmax) de 363 °C, mientras que los ChNF desacetilados mostraron la principal región de temperatura de degradación a ⁓ 359 °C con una pequeña cresta a ⁓ 320 °C. La aparición del pico de degradación térmica a ⁓ 320 °C se atribuyó a la degradación de unidades de 2-amino-2-desoxi-d-glucopiranosa52,53. Al aumentar el tiempo de desacetilación, el pico ubicado a ⁓ 320 °C se volvió más pronunciado, pero la intensidad del segundo pico a ⁓ 359 °C se redujo. Esto se debió a la gran cantidad de grupos amino en las moléculas de quitina, que son menos estables térmicamente que los grupos acetamido54.

Además, la estabilidad térmica de las muestras de ChNF desacetilada disminuyó al aumentar el tiempo de tratamiento de desacetilación debido al alto contenido de grupos amino en las moléculas de quitina (Tabla 1). La temperatura de degradación térmica con una pérdida de peso del 1% (T1%) de CO fue de 237,0 °C. Después del tratamiento de desacetilación durante 120 min, el T1% de C120 se redujo considerablemente a 225,3 °C. La temperatura reducida de degradación térmica del C120 fue atribuible a la conversión parcial de los grupos acetamido en grupos amino. Asimismo, C240 ​​y C480 exhibieron valores de T1% de 222,6 °C y 220,2 °C, respectivamente. Además, se produjo una reducción en el Tmax de ChNF con la introducción de la desacetilación. Los valores de Tmax de C0 y C120 fueron 363,6 °C y 359,5 °C, respectivamente. Sin embargo, no se observó ningún cambio significativo en Tmax al aumentar el tiempo de procesamiento de desacetilación. Además, se observó un mayor contenido de residuos de carbón a 800 °C (> 24,0%) en los ChNF desacetilados, en comparación con los ChNF no desacetilados (C0) (13,5%). Esto ocurrió debido a la mayor cantidad de grupos amino disponibles en las estructuras de quitina desacetilada55. Por lo tanto, un foco de nuestro trabajo futuro sería la aplicación de ChNF desacetilados como agente de refuerzo en matrices poliméricas para mejorar las propiedades mecánicas y retardantes de llama55,56.

Se estudió el efecto del tiempo de tratamiento de desacetilación sobre la estabilidad de la suspensión de ChNF. La Figura 3 presenta la estabilidad de las suspensiones de ChNF con diferentes tiempos de almacenamiento. La suspensión de C0 (sin desacetilación) mostró una precipitación rápida después de 10 minutos, mientras que se observó una sedimentación notable de C120 después de almacenarla a temperatura ambiente durante 4 h. Se observó una clara precipitación de C240 ​​después de 7 días, pero no se observó floculación para la suspensión de C480 incluso después de 180 días. Esto indicó una mayor estabilidad de la suspensión de ChNF con un tiempo de tratamiento de desacetilación más prolongado. La estabilidad superior del C480 se atribuyó a la alta conversión de grupos acetamido en grupos amino en la estructura de quitina. Debido al efecto de protonación de estos grupos amino (NH3+), se fibrilaron nanofibras individualizadas superiores y se produjo una agregación reducida a través de fuerzas de repulsión electrostática10. Li et al.10 compararon ChNF no desacetilados y desacetilados extraídos de la misma fuente de quitina y encontraron que, aunque las arquitecturas geométricas de los ChNF no desacetilados y desacetilados no se vieron afectadas por el tratamiento de desacetilación, el mayor contenido de grupos amino en el ChNF desacetilado La estructura podría reducir la agregación de fibras, lo que resultaría en una mayor estabilidad de la suspensión de ChNF desacetilada. Además, se observó una disminución de la viscosidad de un orden de magnitud después del tratamiento de desacetilación.

Fotografías de los ChNF desacetilados dispersos en agua destilada con unas gotas de ácido acético (pH ⁓ 3) en función del tiempo de precipitación: inmediatamente después de mezclar (0 min) y después de almacenar a temperatura ambiente durante tiempos diferentes en comparación con el agua destilada (izquierda). ).

Las cargas positivas en las superficies de ChNF se investigaron con respecto al tiempo de reacción de desacetilación mediante análisis de potencial ζ. Se encontró que el valor promedio del potencial ζ de los ChNF aumentaba al aumentar el tiempo de tratamiento de desacetilación. C0 tenía un valor de potencial ζ de + 20,3 mV, y después de la desacetilación durante 120 minutos, el potencial ζ aumentó considerablemente a + 31,9 mV (C120). Se midieron los valores de potencial ζ de + 42,0 y + 44,0 mV para C240 ​​y C480, respectivamente. El aumento del potencial ζ respaldó la mayor conversión de grupos acetamido en la columna vertebral de quitina a grupos amino con un tiempo de tratamiento de desacetilación más prolongado21.

En la Fig. 4 se comparan las imágenes TEM de los ChNF después de varios tiempos de tratamiento de desacetilación (0 a 480 min). La desfibrilación de nanofibras de exoesqueletos de camarón se realizó para todos los materiales de quitina con o sin tratamiento de desacetilación. Se desintegró C0 con anchos de <20 nm y se observaron grandes agregados de nanofibras en el rango de 100 a 300 nm. La presencia de estos haces de fibras fue causada por fuertes enlaces de hidrógeno entre nanofibras asociados con un alto grado de cristalinidad27,30, lo que provocó la rápida deposición de C0 después de 10 min (Fig. 3). Sin embargo, los grupos acetamido se convirtieron en grupos amino después de la desacetilación, reduciendo el enlace intermolecular entre las nanofibras27. Esto condujo a la individualización de los ChNF mediante una simple desintegración mecánica27,30. Para C120, aumentó el número de ChNF individualizados con anchos de <20 nm; sin embargo, todavía había grandes haces de fibras. La fibrilación exitosa de ChNF individualizados tipo espagueti se produjo después de que las partículas de quitina se desacetilaron durante 240 minutos; C240 tenía un ancho promedio de 9,0 ± 1,8 nm y longitudes de hasta varios μm. Esto se atribuyó a las altas fuerzas de repulsión electrostática resultantes de la protonación de grupos amino en la estructura de quitina entre las fibras, como lo confirman los análisis de potencial ζ y de RMN25,30. En particular, durante la desintegración mediante mezcla a alta velocidad, el pH de la dispersión de quitina se redujo a ⁓ 3 usando ácido acético, lo que generó cargas positivas en los grupos amino (NH3+)25,30. Los anchos de los ChNF preparados aquí fueron similares a los de los ChNF preparados mediante homogeneización y molienda industrial a alta presión10,25. Sin embargo, la arquitectura morfológica de C480 cambió inesperadamente de una estructura similar a una fibrilla a una estructura similar a una varilla. El ancho y largo promedio de C480 fueron 7,3 ± 1,8 nm y 222,3 ± 94,4 nm, respectivamente. El acortamiento de las nanofibras podría resultar de la combinación del largo tratamiento de desacetilación alcalina y la fibrilación mecánica. Ji et al.57 descubrieron que la desacetilación interactuaba predominantemente con la región amorfa de la quitina, lo que llevaba a la disolución de la parte amorfa desacetilada en una solución ácida. En consecuencia, esto resultó en una longitud más corta de ChNFs58. Se observó un fenómeno similar de reducción de la longitud para los ChNF con una DA más baja. A medida que la DA de los ChNF disminuyó del 89,2 al 71,6 %, la longitud promedio de los ChNF mostró una disminución significativa de 895 ± 551 nm a 428 ± 270 nm58.

Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de los ChNF desacetilados.

En este documento, se investigó la aplicación de suspensiones de ChNF para prolongar la vida útil de pepinos frescos. Se seleccionaron pepinos frescos como modelo alimentario para probar la eficacia de los recubrimientos ChNF, ya que son un producto fresco económicamente importante que se consume en todo el mundo. Los pepinos locales se recubrieron directamente con suspensiones de ChNF con una concentración del 0,75% en peso (C0, C120, C240 ​​y C480) y se controlaron diariamente. La apariencia visual de los pepinos recubiertos y sin recubrimiento se presenta en la Fig. 5a, y la pérdida de peso de los pepinos en función del tiempo de almacenamiento se presenta en la Tabla 2. La frescura de las frutas y verduras se puede determinar mediante el cambio de color y la pérdida de peso59 ,60. La pérdida de peso es un factor crucial, lo que implica la calidad y vida útil de los productos agrícolas61,62. La pérdida de agua o humedad de los productos frescos podría provocar cambios metabólicos en las células vegetales, lo que acelera la senescencia y afecta negativamente el contenido nutricional del producto61. Después de 1 día de almacenamiento, todas las muestras de pepino permanecieron verdes y frescas sin signos de descomposición. No se observó diferencia en la pérdida de peso de los pepinos con la aplicación de los recubrimientos de ChNF entre los días 0 y 1. Sin embargo, el pepino sin recubrimiento (control) mostró una pérdida de peso significativa entre los días 0 y 1 (p <0,05). Esta pérdida de peso se atribuyó principalmente a la pérdida de humedad de los pepinos4,11. Al aumentar la duración del almacenamiento, la pérdida de peso de las muestras de pepino aumentó en todos los tratamientos. Después de 3 días de almacenamiento, todos los pepinos con y sin recubrimientos de ChNF todavía estaban verdes, pero un área cercana al tallo estaba arrugada en todas las muestras. Esto estuvo de acuerdo con los resultados de la pérdida de peso. Esta sequedad fue más pronunciada el día 5 y se observó fácilmente a simple vista. Los pepinos recubiertos con C120 y C240 ​​mostraron una menor pérdida de peso que las otras muestras (control, C0 y C480), mientras que los pepinos recubiertos con C0 y C480 mostraron resultados de pérdida de peso similares a los de los pepinos sin recubrimiento (control). Esto indica que los recubrimientos C120 y C240 ​​podrían retrasar la pérdida de humedad de los pepinos. Se encontró que la pérdida de peso de los pepinos tiene una fuerte relación con su pérdida de volumen63. Además, se observaron mayores tasas de pérdida de peso en función de la duración del almacenamiento en los pepinos recubiertos con C0 (-5,25% día-1) y C480 (-5,22% día-1) y las muestras de control (-4,60% día-1). en comparación con el de los pepinos recubiertos con C120 (- 3,98% día-1) y C240 ​​(- 3,92% día-1) (Fig. 5b). Con el aumento del tiempo de almacenamiento, la diferencia entre estos dos conjuntos se hizo más pronunciada. La menor tasa de liberación de humedad de los pepinos recubiertos con C120 y C240 ​​podría deberse a la mayor fibrilación de sus ChNF (menos agregación) en comparación con el C0 y a las longitudes de fibra más largas en comparación con el C480. Las fibras con anchos más pequeños pueden formar una red con tamaños de poro más pequeños59,64. Además, las nanofibras largas adyacentes formarían una red interconectada con mayores cantidades de enlaces de hidrógeno en las superficies del pepino, que retendrían moléculas de agua65; sin embargo, los ChNF estructurados en forma de varilla pueden encontrar desafíos para formar una red comparable debido a su longitud más corta, como se muestra en la Fig. 5c.

(a) Aspecto visual y (b) cambio de peso de pepinos recubiertos con ChNF preparados con varios tiempos de desacetilación (control, C0, C120, C240 ​​y C480) condicionados a 30 ± 3 °C en función del tiempo de almacenamiento. (c) Esquema que ilustra los ChNF estructurados en forma de espagueti (C120 y C240) y los ChNF estructurados en forma de varilla (C480) cubiertos sobre superficies de pepino, y (d) zonas claras de inhibición de los ChNF preparados con varios tiempos de desacetilación (C0, C120, C240 , y C480) contra Escherichia coli (E. coli) y Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium). Como control se utilizó ácido acético al 1%.

Además, en comparación con las nanofibras cortas, las nanofibras más largas formarían una vía de difusión más larga en las superficies del pepino que retrasaría el transporte de moléculas de gas66. La permeación de moléculas de gas como agua y O2 a través de los poros dentro de una red de nanofibras también estaría controlada por la densidad de la red65. Estos hallazgos sugirieron que los ChNF (C120 y C240) utilizados como recubrimientos para extender la vida útil de los pepinos frescos podrían aplicarse potencialmente a otras frutas y verduras frescas, permitiendo una reducción en los envases de un solo uso, que dañan nuestro medio ambiente y ponen en peligro tanto a los seres humanos como a los humanos. y animales.

Se realizó una evaluación cualitativa de la actividad antimicrobiana de los ChNF contra E. coli y S. Typhimurium, dos patógenos gramnegativos transmitidos por los alimentos que generalmente se encuentran en productos crudos de origen tanto vegetal como animal67,68,69. Se observó una clara zona de inhibición contra E. coli y S. Typhimurium cuando se dejaron caer directamente 10 µL de solución C120, C240 ​​o C480 (0,75 % en peso) sobre el césped bacteriano, mientras que esto no se observó para C0 (Fig. 5d). Los resultados sugirieron que el tiempo de desacetilación y la DA afectaron la actividad antimicrobiana de los ChNF contra las bacterias analizadas. Tsigos et al.70, Hongpattarakere y Riyaphan71, y Benhabiles et al.72 observaron una tendencia similar, quienes informaron que la actividad antimicrobiana de la quitina y el quitosano mejoró en parte mediante el proceso de desacetilación. Aquí, la desacetilación durante 120 minutos fue suficiente para convertir ChNF inactivos (C0, DA = 95,3%) en ChNF antimicrobianos (C120, DA = 76,2%).

Con base en estas actividades antibacterianas observadas in vitro utilizando el método de la mancha en el césped, solo se probaron C120, C240 ​​y C480 contra E. coli y S. Typhimurium en las superficies exteriores de pepinos frescos. Este experimento tuvo como objetivo investigar los efectos antimicrobianos de los ChNF en las condiciones de uso previsto en la superficie de productos frescos. El estudio de exposición bacteriana reveló la eficacia antimicrobiana de los ChNF probados contra E. coli y S. Typhimurium en pepinos durante el almacenamiento refrigerado (Tabla 3). Todos los ChNF probados inhibieron eficazmente el crecimiento de E. coli manteniendo la viabilidad bacteriana en los niveles inoculados durante 7 días de almacenamiento; sin embargo, la cantidad de E. coli en el grupo de control aumentó significativamente desde el primer día de almacenamiento. No se observaron diferencias significativas (p > 0,05) entre los grupos de ChNF durante este período de almacenamiento. Los resultados sugirieron que las potencias de C120, C240 ​​y C480 contra E. coli en este modelo alimentario no eran diferentes. En cuanto a S. Typhimurium, las aplicaciones de C120 y C240 ​​en las superficies exteriores del pepino redujeron significativamente (~ 90%) la viabilidad de la bacteria en un día. Los resultados indicaron que S. Typhimurium murió rápidamente cuando se expuso a C120 y C240. Sin embargo, el día 3 de almacenamiento, los números de S. Typhimurium en los grupos C120 y C240 ​​aumentaron a su nivel inicial y no fueron diferentes del control (p > 0,05). Este resultado sugirió que la concentración aplicada de C120 y C240 ​​podría ser insuficiente para matar todas las bacterias en la superficie del pepino; por tanto, las células viables residuales pudieron crecer posteriormente. Por el contrario, en cuanto al C480, la viabilidad de S. Typhimurium en las superficies del pepino no cambió significativamente durante el almacenamiento, aunque su actividad antimicrobiana se visualizó mediante el ensayo de la mancha en el césped. Los hallazgos sugirieron que, a diferencia del C120 y el C240, el C480 podría no matar las bacterias. En cambio, podría exhibir una acción bacteriostática (inhibición bacteriana) contra S. Typhimurium.

El mecanismo antimicrobiano preciso y los factores que afectan la actividad antimicrobiana de la quitina aún están en desarrollo. El mecanismo propuesto con mayor frecuencia es el apilamiento electrostático de quitina cargada positivamente sobre la superficie celular bacteriana cargada negativamente, lo que en consecuencia interfiere con el metabolismo celular y la permeabilidad de la membrana celular de las bacterias10,73,74. Xu et al.75 encontraron que las propiedades antibacterianas de los ChNF dependían en gran medida del DA debido a las mayores cantidades de grupos amino. En este sentido, inicialmente se esperaba que el C480 inhibiera las bacterias analizadas en mayor medida que el C120 y el C240. De hecho, la discrepancia requiere una mayor investigación. Sin embargo, los hallazgos sugirieron que, en lugar de la carga sola, existen otros factores (p. ej., ancho y largo de la fibra) que afectan las actividades antimicrobianas del ChNF. Aquí, C120, C240 ​​y C480 tuvieron ligeras diferencias en DA (de 76 a 69%) y potencial ζ (de + 31,9 a + 44,0 mV). Se podría especular que los ChNF más cortos (una estructura en forma de varilla) podrían ser insuficientes para apilar o cubrir la superficie de la célula bacteriana, exhibiendo así una acción antimicrobiana más débil (Fig. 5c). Esto coincidió con la mayor tasa de pérdida de peso de los pepinos recubiertos con C480 que los pepinos recubiertos con C120 y C240.

En general, los hallazgos actuales sugirieron que las suspensiones de ChNF (C120 y C240) pueden extender la vida útil de los pepinos frescos al reducir la pérdida de humedad y retrasar el crecimiento de S. Typhimurium, que vinculó miles de casos de Salmonella spp. brotes en América del Norte76,77 y el Reino Unido78. Además, la quitina, un material biodegradable, biocompatible y no tóxico, se ha utilizado ampliamente en diversas aplicaciones, incluidos biomateriales, conservación de alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos17,18,79. Sin embargo, han surgido preocupaciones sobre posibles alergias a los mariscos provocadas por la quitina. Las alergias a los mariscos, particularmente la alergia a los camarones, se han asociado con las proteínas musculares que se encuentran en los mariscos80. Es importante señalar que las proteínas se eliminaron durante el proceso de preparación de la quitina. Un estudio sobre la seguridad del quitosano (un derivado de la quitina) en personas alérgicas al camarón encontró que el vino procesado con quitosano como agente conservante no inducía reacciones alérgicas en pacientes con alergia al camarón80. Dado que la quitina y el quitosano tienen estructuras similares, esta investigación proporciona información adicional sobre la utilización de ChNF y respalda la seguridad de su consumo. En nuestro trabajo futuro, planeamos explorar los residuos de ChNF en productos frescos después del lavado, lo que nos ayudará a comprender la posible limitación de los recubrimientos de ChNF.

Se desarrollaron con éxito ChNF con varios DA (95%, 76%, 73% y 69%) a partir de desechos de cáscara de camarón mediante desacetilación con NaOH y desfibrilación mecánica. Los tiempos de reacción de desacetilación más prolongados dieron como resultado una mayor sustitución de los grupos acetamido por grupos amino en las moléculas de quitina, lo que redujo la DA y la estabilidad térmica. Estos grupos amino impartieron una actividad antibacteriana prometedora a los ChNF. Con un mayor tiempo de reacción, se logró la individualización de ChNF y una mayor estabilidad de la suspensión de ChNF. Además, la estructura similar a un espagueti de los ChNF se convirtió en una estructura similar a una varilla cuando el tiempo de reacción de desacetilación aumentó a 480 min. Además, aplicamos estos ChNF como recubrimiento para extender la vida útil de los pepinos frescos. Las suspensiones ChNF tipo espagueti (C120 y C240) impidieron considerablemente la pérdida de humedad y retrasaron el crecimiento de S. Typhimurium en las superficies exteriores del pepino en comparación con el C480 individualizado en forma de varilla. Por lo tanto, las suspensiones sostenibles de ChNF son un enfoque prometedor para reducir el desperdicio de alimentos y reemplazar los polímeros a base de petróleo para el envasado de alimentos.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Este proyecto está financiado por el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia (NRCT) (Subvención No. N41A640090). S. Tanpichai desea expresar su agradecimiento a la Fundación Científica Toray de Tailandia por el apoyo financiero brindado a través de la subvención de investigación en ciencia y tecnología (28º TTSF, 2021). También le gustaría expresar su más profundo agradecimiento al Prof. Hiroyuki Yano por sus valiosas sugerencias e inspiración en la vida. Un agradecimiento especial a la señorita Natthaya Methaveephan, Mstr. Skoravit Tanpichai y Mstr. Montapicha Tanpichai por su genuina asistencia en la aplicación de recubrimientos ChNF para prolongar la vida útil de los pepinos frescos. Su dedicación y apoyo fueron realmente apreciados.

Instituto de Aprendizaje, Universidad Tecnológica del Rey Mongkut Thonburi, Bangkok, 10140, Tailandia

Supachok Tanpichai

Grupo de Investigación de Celulosa y Nanomateriales de Base Biológica, Universidad Tecnológica del Rey Mongkut en Thonburi, Bangkok, 10140, Tailandia

Supachok Tanpichai

Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC), Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología (NSTDA), Pathum Thani, 12120, Tailandia

Laphaslada Pumpuang, Yanee Srimarut, Weerapong Woraprayote y Yuwares Malila

Centro Internacional Conjunto de Investigación sobre Seguridad Alimentaria (IJC-FOODSEC), Parque Científico de Tailandia, Pathum Thani, 12120, Tailandia

Yuwares Malila

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ST: conceptualización; curación de datos; análisis formal; fondos; investigación; metodología; administración de proyecto; recursos; escritura—borrador original; Escritura: revisión y edición. LP: curación de datos; análisis formal; metodología. YS: curación de datos; análisis formal; metodología; escritura—borrador original. WW: curación de datos; análisis formal; investigación; metodología; roles/escritura: borrador original; Escritura: revisión y edición. YM: conceptualización; curación de datos; investigación; escritura—borrador original; Escritura: revisión y edición.

Correspondencia a Supachok Tanpichai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Tanpichai, S., Pumpuang, L., Srimarut, Y. et al. Desarrollo de recubrimientos de nanofibras de quitina para prolongar la vida útil e inhibir el crecimiento bacteriano en pepinos frescos. Informe científico 13, 13195 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39739-6

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Recibido: 21 de junio de 2023

Aceptado: 30 de julio de 2023

Publicado: 14 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39739-6

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